一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用
【技术领域】
[0001] 利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法 和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。
【背景技术】
[0002] 淀粉，作为微生物工业碳源的主要来源，一般需要经过液化和糖化两个阶段才能 为微生物所利用。能直接利用淀粉作为碳源的微生物主要有链霉菌属、解淀粉芽孢杆菌及 各种霉菌，而大部分用于生产的菌种无法直接利用淀粉作为碳源。现国内外已有报道，改造 酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性 生产L-赖氨酸的相关报道。
[0003] 发明人前期工作已获得通过相关基因工程和代谢工程技术改造的高产L-精氨酸 的菌种：钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890(已在专利CN03112896. 3中公开）。
[0004] 发明人获得的高产L-精氨酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-精氨 酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源。
[0005] L-精氨酸作为半必需氨基酸，在医药工业，保健品、食品等领域皆有广泛的应用。 通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产L-精氨酸菌种，使其能利用淀粉作为碳源 发酵生产L-精氨酸。对简化L-精氨酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的α-淀粉酶基因与来源谷氨酸棒 状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，并比 对α_淀粉酶在L-精氨酸尚广菌种中的分泌效果，得到β-甘露聚糖基因的彳目号肽 MannaseSignalPeptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。
[0007] 所述MSP核苷酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0008] 本发明在已有高产L-精氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术将β-甘露聚糖基 因的信号肽融合到去掉自身信号肽的α-淀粉酶基因，构建表达载体导入到L-精氨酸高产 菌中，并成功表达。使其能以可溶性淀粉和葡萄糖作为混合碳源进行L-精氨酸发酵。
[0009] 所述高产L-精氨酸菌种为本研究室前期构建的钝齿棒状杆菌CGMCCΝ0. 0890。
[0010] 本发明构建的重组菌钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890/pMSPamy经优化在50g/L可溶 性淀粉和l〇〇g/L葡萄糖做为混合碳源的5L发酵罐中发酵96h，L-精氨酸产量为48 ± 0. 7g/ L，其中发酵液α-淀粉酶的酶活为2126± 12. 4U/mL。
[0011] 所述的技术方案：
[0012] 1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。
[0013] 2.重组菌的构建
[0014] 从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩 增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检 验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶对相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶 切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光 度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下 过夜连接。将连接产物用CaCl2转化法转入E.coliBL21，获得含重组质粒的E.coliBL21。 提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将 含15%甘油的重组菌液保存-70°C冰箱。
[0015] 3.重组菌的产酸培养
[0016] 将重组菌接种于新鲜的LB+0. 5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1 %。 次日以1%转接于发酵培养基中（底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mMIPTG诱导表 达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量（L-精氨酸及相关氨基 酸等）。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。
[0017] 4.重组菌的产酶培养
[0018] 将重组菌接种于新鲜的LB+0. 5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1 %。 次日以1 %转接于发酵培养基中（底物为葡萄糖），0. 8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发 酵液测其酶活和蛋白含量。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :信号肽引物与α-淀粉酶串联的引物设计
[0020] 根据NCBI上公布的相关基因序列和α-amyase基因序列设计信号肽和基因串联 的大片段引物。
[0021] Pl:pMSPamyHindIIIF
[0025] 实施例2 : α-淀粉酶基因的信号肽替换及其克隆
[0026] [1]从Str印tomyces kathiraeCCTCCM201?32提取染色体作为模板DNA。
[0027] [2]根据NCBI网站上公布的α-淀粉酶基因序列设计信号肽和基因串联的PCR引 物。以Str印tomyceskathiraeCCTCCΜ2012432的基因组为模板利用大片段引物PCR，得 到带有经密码优化的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示Mannasesignalpeptide(简称MSP) 信号肽的α-淀粉酶基因。PCR扩增体系（50μL):模板1μL，上下游引物各0. 5μL，dNTP Mix4yL，10XExTaqBuffer5yL，灭菌ddH20 38.5yL，ExTaqDNA聚合酶 0.5yL。 PCR反应条件：94 °C预变性，5min，一个循环；94 °C变性，30s，56 °C退火，30s，72 °C延伸， lmin30s，30个循环；72°C，10min，一个循环；4°C，10min，一个循环（其中退火温度和延伸时 间根据不同引物和基因进行相对的调节）。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回 收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1. 5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。
[0028] 实施例3:重组质粒pXMJ19_MSPamy的构建
[0029] [1]构建重组质粒pMD18-T-MSPamy，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产 物与克隆载体PMD18-T连接，连接体系为solutionI5μL，目的基因4. 8μL，pMD18-T质 粒0. 2μL，16°C过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109,涂布于含100ug/mL氨苄青霉素 的LB平板，经37°C培养过夜，挑取单菌落到含100ug/mL氨苄青霉素的10mL液体LB培养 基中，37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPamy，经PCR和酶切验证连接成功 后，将菌液加入甘油于-70 °C冰箱保藏。
[0030] [2]将[1]中提取的pMD18-T-MSPamy质粒与表达载体pXMJ19分别进行Hindlll 与BamHI的双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pXMJ19-MSPamy。 上述重组质粒都通过PCR和酶切验证。
[0031] 实施例4:重组质粒pXMJ19-MSPamy电转化至钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890
[0032] 挑取钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890接种