一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载 体的构建及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因沉默是研究基因表达调控及揭示机体分子遗传方面表达本质的重要方式。 RNA干扰（RNAi)是一种常用的基因沉默方法，通过人为设计与特定基因mRNA同源的干扰 RNA实现特异性基因表达下调。
[0003] RNAi载体是成功实现特异性基因沉默的必要条件，可以实行基因消除，基因功能 研究或转基因作物培育。现有商用RNAi载体多用于动物宿主细胞，少数能用于植物的RNAi 载体，如pHANNIBAL，但为非双元表达载体，不能用于农杆菌介导的植物遗传转化。
[0004] 经对现有技术文献检索发现，尚未发现有关pC1300-pHANNIBAL植物基因沉默载 体及构建的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于丰富植物RNAi载体库，提供一个新的广泛用于植物基因沉默 的RNAi载体一一pC1300-pHANNIBAL载体。本发明的另一目的在于提供上述广泛用于多种 植物基因沉默的RNAi载体的构建方法及其应用。
[0006] 本发明的主要技术方案是：将pHANNIBAL上的CMV-PDK-0CS分片段通过PCR扩增 和限制性内切酶酶切、连接技术，依次连入PCAMBIA1300双元载体的多克隆位点构建获得 pC1300-pHANNIBAL载体。本发明获得的pC1300-pHANNIBAL载体是一个既能在菌中表达又 能在植物中表达的双元表达载体。通过将目标基因片段正反插入pC1300-pHANNIBAL载体 PDK两端，获得目标基因的RNAi载体；经基因转化，获得相应的转基因材料；最终实现基因 沉默或基因功能研究的目标。
[0007] 本发明的第一方面，是提供了一种RNA干扰载体，即一种广泛用于多种植物 基因沉默的RNAi载体，该载体以植物双元表达载体pCAMBIA1300为基础，在多克隆位 点处插入来源于pHANNIBAL载体的CMV启动子，PDK内含子和0CS终止子，最终形成 pC1300-pHANNIBAL载体。
[0008] 其中，所述CMV和0CS通过PCR扩增获得，经酶切、连接依次插pCAMBIA1300,获得 PC1300-CMV-0CS;所述PDK直接从pHANNIBAL酶切获得，然后插入pC1300-CMV-0CS的CMV 和 0CS之间，获得pC1300-pHANNIBAL;
[0009] 该载体中，所述CMV和PDK之间含有3个多克隆酶切位点（SacI，NcoI及ΚρηI)， 可以正向插入目标基因的片段；PDK和0CS之间含有4个酶切位点（HindIII，BamHI，Xba I和SalI)，BamHI，XbaI和SalI为单酶切位点，可以反向插入目标基因的片段。
[0010] 其中所述的CMV启动子，其核苷酸序列为SEQIDNO: 1所示。
[0011] 其中所述的Η)Κ内含子，其核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。
[0012] 其中所述的0CS终止子，其核苷酸序列为SEQIDNO:3所示。
[0013] 其中所述的pC1300-pHANNIBAL载体，其核苷酸序列为SEQIDN0:4所示。
[0014] 本发明的第二方面，是提供了上述广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体的构 建方法，包含以下步骤：
[0015] 步骤一，利用F35S,R35S扩增pHANNIBAL上的启动子CMV，连接Blunt-zero载体， 获得正确的中间载体Blunt-CMV;
[0016] 步骤二，双酶切Blunt-CMV，连接到pCAMBIA1300 上，得到 1300-CMV;
[0017] 步骤三，利用OCSF，0CSR扩增pHANNIBAL上的终止子0CS，连接Blunt-zero载体， 获得正确的中间载体Blunt-OCS;
[0018] 步骤四，双酶切Blunt-〇CS，连接到 1300-CMV上，得到 1300-CMV- 0CS;
[0019] 步骤五，双酶切pHANNIBAL上的PDK片段，连接到1300-CMV- 0CS上，最终构建获 得pC1300-pHANNIBAL载体。
[0020] 其中步骤一所述的利用F35S，R35S扩增pHANNIBAL上的启动子CMV是指以含EcoR I酶切位点的F35S和含SacI及NcoI酶切位点的R35S为引物，所述F35S如SEQIDN0:5 所示，R35S如SEQIDNO:6所示。
[0021] 其中步骤三所述的利用0CSF，0CSR扩增pHANNIBAL上的终止子0CS是指以含Xba I和SalI酶切位点的0CSF和含HindIII酶切位点的0CSR为引物，所述0CSF如SEQID NO:7 所示，0CSR如SEQIDNO:8 所示。
[0022] 进一步地，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含SEQIDNO:4所示的基 因。
[0023] 所述宿主细胞为大肠杆菌（Escherichiacoli)或农杆菌（Agrobacterium)。
[0024] 本发明的第三方面，是提供了上述广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体在基 因转化中的应用。
[0025] 进一步地，本发明还提供了上述广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体在制备 转基因植物中的应用。
[0026] 本发明所提及的RNAi载体为一种通用工具，在基因转化中以及在制备转基因植 物中的应用，具体可参见实施例3和实施例4。
[0027] 本发明的有益效果如下：
[0028] 本发明成功获得能够整合到多种植物基因组中，并能稳定遗传、表达的用于基因 沉默RNAi载体--pC1300-pHANNIBAL，是一种方便可靠、经济实用的基因沉默手段；此外， 该载体已经成功用于构建青蒿TAR1基因、菘蓝PLR基因，以及丹参MYC2a、MYC2b等基因的 RNAi载体，非常成功地实现TAR1基因、PLR基因和MYC2a、MYC2b等基因的沉默，并成功开展 这些基因的相关功能研究和植物次生代谢工程。
[0029] pC1300-pHANNIBAL载体可被广泛用于多个物种基因功能的研究，遗传改造，分子 育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
【附图说明】
[0030] 图1为pC1300-pHANNIBAL载体构建示意图。
[0031] 图2为TARl-RNAi载体示意图。
[0032] 图3为TARl-RNAi转基因青蒿PCR鉴定电泳图：1-28代表不同的TARl-RNAi转基 因株系，P表示阳性对照，Μ为Maker DL2000, N表示阴性对照。
[0033] 图4为TARl-RNAi转基因青蒿定量PCR结果：Control，为野生型对照；RNAi-数字， 为不同的TARl-RNAi转基因株系。
[0034] 图5为TARl-RNAi转基因青蒿含量测定结果：A-C，分别青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿 酸在叶中的含量测定结果；D-F，分别青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸在花苞中的含量测定结 果。
[0035] 图6为PLR-RNAi载体示意图。
[0036] 图7为PLR-RNAi转基因菘蓝毛状根PCR鉴定电泳图：Μ为MakerDL2000，P表示阳 性对照，WT表示阴性对照，1-5代表不同的PLR-RNAi转基因菘蓝毛状根。Rolb，为Ri质粒 的一段基因序列；hpt，为潮霉素抗性基因的一段序列；intron，基因序列和部分载体序列。
[0037] 图8为PLR-RNAi转基因菘蓝毛状根定量PCR结果：WT，为野生型对照；CK，为空载 体转基因对照；i-数字，为不同的PLR-RNAi转基因菘蓝毛状根。
[0038] 图9为PLR-RNAi转基因菘蓝毛状根落叶松脂素含量变化情况：A，落叶松脂素含量 含量测定结果；B，PLR-RNAi阳性菘蓝毛状根间苯三酚一盐酸染色结果。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件 所做的修改或替换均属于本发明的范围。
[0040] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0041] 实施例1 :CMV启动子和0CS终止子的克隆
[0042] 1.pHANNIBAL质粒提取
[0043] 挑取含有pHANNIBAL载体的Transl-Tl大肠杆菌（购自TransGenBiotech)，先于 750μ1LB培养基（称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g共同溶解于1L水中，调节 pH= 7. 0,121°C灭菌后，冷却至50°C，加入终浓度为100mg/L的氨苄抗生素）中培养过夜； 接种20μ1菌液于20mlLB培养基中，过夜培养；用1. 5mlEP管12000rpm离心lmin收集 菌体（每5ml菌液收集为一管）。
[0044]向菌体中加入 100μ1 溶液I(葡萄糖 50mmol/L，Tris-Cl25mmol/L，EDTA10mmol/ L，pH= 8. 0)，重悬沉淀；再加入 200μ1 溶液II(H20 8ml，10%SDSlml，2MNaOHlml)，轻 柔的翻转EP管，5~6次至溶液变澄清；加入150μ1溶液III(H20 28. 5ml，冰乙酸11. 5ml， 5MKAc60ml)，轻柔翻转，至溶液中出现白色悬浮物，将EP管放置于-20°C条件下15min，然 后12000rpm离心10min;将上清转入另一干净EP管中；加入2倍体积无水乙醇，-20°C放置 30111；[11;12000印1]1离心10111；[11弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤；12000印1]