一种提高棉花转基因效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及棉花栽培领域，具体涉及一种提高棉花转基因效率的方法。
【背景技术】
[0002]利用基因工程技术对棉花进行遗传改良已取得重要进展。棉花茎尖具有直接分化再生的特点，一经转化就可以在适当培养条件下诱导叶、根的形成而获得转基因植株。农杆菌介导的茎尖转化方法不仅能够解决基因型依赖性问题，还可缩短转化周期和提高移栽成活率。。然而以农杆菌转化为主的植物转基因技术目前存在转化效率低下的问题，大部分植物的转化率为1%左右，这个问题也成为了限制转基因植物产业化生产的主要因素。研究表明，农杆菌浸泡受体植物材料时，只有表层的少数受创伤细胞有可能被转化，而受体材料中的大部分内部细胞没有机会接触到农杆菌。
【发明内容】
[0003]为解决上述冋题，本发明提供了一种提尚棉花转基因效率的方法，其可有效提尚转基因效率明以及转基因棉花的结铃率。
[0004]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
一种提尚棉花转基因效率的方法，包括如下步骤:
51、将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在6000-11000rpm条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液；
52、将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，在20-25°C下，4800-8200rpm离心5-10min，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理15-20分钟；
53、处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有浓度为0.2-0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、浓度为0.1-0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和浓度为0.05?0.2mg/L的α -萘乙酸的共培养培养基上进行共培养；
54、共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。
[0005]优选地，所述共培养培养基为改良MS+0.04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/LIBA+35g/L蔗糖培养基。
[0006]优选地，所述改良MS包括营养元素和有机物，营养元素包括蛋氨酸锰10mg/L、，一水硫酸锌5mg/L、一水硫酸亚铁17mg/L、氨基酸螯合镁5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、碱式硫酸铜4.5mg/L、卩比啶酸络0.065mg/L、碘酸|丐0.3mg/L、赖氨酸6mg/L、三氯化六氨合钴0.065mg/L、蛋白锗0.75mg/L、碘酵母6mg/L。
[0007]优选地，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L。
[0008]优选地，所述棉花无菌苗茎尖为生长2-3天的棉花无菌苗茎尖。
[0009]优选地，所述步骤S2中超声波输出功率为320±20W，超声波处理的频率为68KHz ?72KHz。
[0010]本发明具有以下有益效果:
通过设置不同的激素(组合)，优化了农杆菌介导的茎尖转化技术体系，使转化周期缩短，转化率提高；选用生长2-3天的无菌苗茎尖为外植体，保证外植体的较强分裂和转化能力；将棉花无菌苗茎尖与农杆菌混合后在合理的转速下进行离心沉降处理和超声波处理，超声波处理可以增加棉花无菌苗茎尖表面的创伤程度，离心沉降不仅可以增加棉花无菌苗茎尖的创伤面积，而且能使农杆菌在离心力作用下深入到棉花无菌苗茎尖内部，显著提高了植物转基因效率。
【具体实施方式】
[0011]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0012]以下实施例中所使用的共培养培养基为改良MS+0.04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/L IBA+35g/L蔗糖培养基；其中，改良MS包括营养元素和有机物，营养元素包括蛋氨酸猛10mg/L、，一水硫酸锌5mg/L、一水硫酸亚铁17mg/L、氨基酸螯合镁5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、碱式硫酸铜4.5mg/L、卩比啶酸络0.065mg/L、碘酸|丐0.3mg/L、赖氨酸6mg/L、三氯化六氨合钴0.065mg/L、蛋白锗0.75mg/L、碘酵母6mg/L，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L，所使用的棉花无菌苗茎尖为生长2-3天的棉花无菌苗茎尖。
[0013]实施例1
51、将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在6000rpm条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液；
52、将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，在20°C下，4800rpm离心5min，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理15分钟；其中，超声波输出功率为300超声波处理的频率为68KHz ；
53、处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有浓度为0.2mg/L的6-糖基氨基嘌呤、浓度为0.lmg/L的吲哚-3-乙酸和浓度为0.05mg/L的α-萘乙酸的共培养培养基上进行共培养；
54、共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。
[0014]实施例2
51、将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在llOOOrpm条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液；
52、将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，在25°C下，8200rpm离心lOmin，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理20分钟；其中，超声波输出功率为340超声波处理的频率为72KHz ；
53、处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有浓度为0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、浓度为0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和浓度为0.2mg/L的α-萘乙酸的共培养培养基上进行共培养；
54、共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。
[0015]实施例3
51、将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在8500条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液；
52、将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，在22.5°C下，6500rpm离心7.5min，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理17.5分钟；其中，超声波输出功率为320W，超声波处理的频率为70KHz ；
53、处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有浓度为0.35mg/L的6-糖基氨基嘌呤、浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸和浓度为0.125mg/L的α-萘乙酸的共培养培养基上进行共培养；
54、共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。
[0016]经检测，上述方法可以使棉花转基因效率提高一倍。
[0017]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在6000-11000rpm条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液； 52、将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，在20-25°C下，4800-8200rpm离心5-10min，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理15-20分钟； 53、处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有浓度为0.2-0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、浓度为0.1-0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和浓度为0.05?0.2mg/L的α -萘乙酸的共培养培养基上进行共培养； 54、共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。2.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述共培养培养基为改良 MS+(X 04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/L IBA+35g/L 蔗糖培养基。3.根据权利要求2所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述改良MS包括营养元素和有机物，营养元素包括蛋氨酸锰10mg/L、，一水硫酸锌5mg/L、一水硫酸亚铁17mg/L、氨基酸螯合镁5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、碱式硫酸铜4.5mg/L、吡啶酸铬0.065mg/L、碘酸钙0.3mg/L、赖氨酸6mg/L、三氯化六氨合钴0.065mg/L、蛋白锗0.75mg/L、碘酵母 6mg/L。4.根据权利要求3所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述有机物包括盐酸硫胺素10mg/L、盐酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、环己六醇27mg/L。5.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述棉花无菌苗茎尖为生长2-3天的棉花无菌苗茎尖。6.根据权利要求1所述的一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述步骤S2中超声波输出功率为320 ±20W，超声波处理的频率为68KHz?72KHz。
【专利摘要】本发明公开了一种提高棉花转基因效率的方法，包括如下步骤：将包含有目的基因的农杆菌活化到转化状态后，在6000-11000rpm条件下离心并重悬，得到农杆菌重悬液；将棉花无菌苗茎尖浸泡到农杆菌重悬液中，离心处理后，转移到无菌玻璃器皿中，静置并超声波处理15-20分钟；处理结束后，将侵染后的棉花茎尖，取出，用无菌滤纸吸干残留的菌液，转移到含有6-糖基氨基嘌呤、吲哚-3-乙酸和α-萘乙酸的共培养培养基上进行共培养；共培养结束后，将侵染后的棉花茎尖在选择压力下进行筛选。本发明可有效提高转基因效率明以及转基因棉花的结铃率。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105274138
【申请号】CN201510745828
【发明人】马燕斌, 张树伟, 王新胜, 吴霞, 李燕娥
【申请人】山西省农业科学院棉花研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月3日