一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高转基因鸡孵化率的方法，同时还涉及该方法使用的蛋壳开口 器，属于生物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和 细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。鸡 具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好的无菌环境，表 达的重组蛋白易提纯、效益高等优点，因此转基因鸡的研究是目前科学研究的热点和生物 制药领域的新兴产业之一。胚盘显微注射法是制备转基因鸡的常用手段，其中鸡蛋开窗法 是鸡胚盘显微注射法的的关键技术之一，它在很大程度上决定了转基因鸡的孵化率。胚盘 显微注射法必须在种蛋上打开一个小窗，这就无可避免的破外了鸡蛋外壳的正常结构，改 变了蛋壳内外的压力平衡和鸡胚发育的内环境，从而造成鸡胚的非正常死亡。同时，开窗处 理使蛋壳受损，极易造成鸡胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研发出一种行之有效的 提高转基因鸡孵化率的方法具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋 壳开口器，能够有效提高转基因鸡的孵化率。
[0004]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种提高转基因鸡孵化率的 方法，包括以下步骤：
[0005] (1)孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理
[0006] 对孵化器进行消毒，种蛋进行预孵化处理，放入孵化箱内开始孵化；l-18d的孵化 温度为37. 8°C，湿度为60%，19-21d的孵化温度为37°C，湿度为78% ;
[0007] (2)种蛋的开口
[0008] 开口前将蛋壳开口器和无菌操作台进行消毒，将孵化12-24h的种蛋从孵化箱内 取出，在种蛋的赤道位置先用碘酊后用75%酒精擦拭消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一 边研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况；
[0009] (3)外源基因的注射
[0010] 将开口后的鸡蛋，开口向上，放在操作台内静置2min，使鸡胚盘的位置漂浮在鸡蛋 的开口处，将含有外源基因的转染液注射入鸡的胚盘中，用抗生素对开口处进行杀菌；
[0011] ⑷种蛋的封口
[0012] 种蛋的封口采用蛋清+蛋壳膜封口的方法，封口后放入孵化箱继续孵化；其中蛋 清+蛋壳膜封口的方法为：将蛋壳膜在蛋清中润洗，然后在开口处覆盖第一层蛋壳膜，再在 第一层蛋壳膜上交叉覆盖第二层蛋壳膜。
[0013] 优选的，第一层蛋壳膜和第二层蛋壳膜呈十字形交叉覆盖。
[0014] 步骤⑴中孵化器的消毒方法为：将孵化器进行清洗，关闭进出气孔和风机，按照 每立方米空间高锰酸钾l〇g，福尔马林15mL的比例依次加入高锰酸钾和福尔马林，混合，当 混合溶液冒烟时，关闭孵化器门，消毒lh，消毒温度为15-20°C，湿度彡75%;
[0015] 步骤⑴中种蛋的预孵化方法为：将新洁尔灭和水按照质量比1:1000的比例配制 成新洁尔灭溶液，其中水温为30°C，将种蛋浸入新洁尔灭溶液中5min，洗净，取出，用脱脂 棉擦拭干净。
[0016] 步骤（3)中抗生素的制备方法：将青链霉素加入生理盐水中，使其终浓度为 〇· 1μg/μL〇
[0017] 所述外源基因为表达载体pEGFP-Nl-p53/MAR，是将人抑癌基因p53和鸡的核基质 附着区MAR基因插入表达载体中构建而成，包括如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0018] 所述表达载体pEGFP-Nl_p53/MAR的构建方法，包括以下步骤：
[0019] (1)抽取癌症病人的外周血液，提取外周血液总RNA，设计上下游引物Primera、 Primerb，RT-PCR扩增人抑癌基因p53,琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；
[0020] RT-PCR反应体系为：2XPCR Buffer 22 yL，上下游引物各1. 5 yL，RT/Taq Master Mix 2 μL，总RNA模板 3μL ;
[0021] RT-PCR反应条件为：①cDNA合成和预变性：40°C、30min，94°C、2min;②PCR扩增 共40个循环：94°C预变性30s、前5个循环65°C退火30s，后35个循环68°C退火30s、72°C 延伸90s;③72°C充分延伸lOmin，反应结束；
[0022] (2)将质粒PMD18-T与人抑癌基因p53 16 °C连接过夜，得到连接产物 pMD18-T-p53 ;将连接产物pMD18-T-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primera、 Primerb，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pMD18-T-p53,再进行 酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pMD18-T-p53 ;
[0023] 所述连接的反应体系为：人抑癌基因p53 8 μL、质粒pMD18_T 2 μL、solution I 10 yL；
[0024] (3)提取鸡肝脏组织中的DNA，设计上下游引物Primerc、Primerd，PCR扩增鸡 MAR基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；
[0025]所述PCR的反应体系为：10X PCR Buffer 3 μL、dNTP Mixture 2 μL、总DNA模板 1.5 μL、上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL，加灭菌去离子水补充至总体积20μL ;
[0026] 所述PCR的反应条件为：①预变性：94°C、4min;②PCR扩增共40个循环，前5个 循环：94°C预变性30s、54°C退火40s、72°C延伸90s;中间五个：94°C预变性30s、56°C退火 4〇8、72°(：延伸9〇8;最后3()个循环：94°(：预变性3〇8、60°(：退火4〇8、72°(：延伸9〇8 ;@721€ 充分延伸l〇min，反应结束；
[0027] (4)将重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-Nl分别用HindIII和BamHI限制 性内切酶双酶切，纯化回收人抑癌基因P53和载体pEGFP-Nl酶切产物，20°C连接5h，得 到连接产物pEGEP-Nl-p53;将连接产物pEGEP-Nl-p53转化感受态细胞，培养，根据上下 游引物Primera、Primerb，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物 pEGEP-Nl-p53,再进行酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pEGEP-Nl-p53;
[0028]所述双酶切的反应体系为：重组质粒pMD18-T-p53或载体pEGFP-Nl20μL、 Buffer Κ5μL、灭菌去离子水 51μL、Hind III和BamH I各 2μL;30°C酶切 4h;
[0029] 所述连接的反应体系为：人抑癌基因p53 5μL、载体pEGFP-Nl酶切产物1μL、T4 连接酶lyL、10XT4DNALigaseBuffer2.5yL，补加灭菌去离子水至总体积为20yL;
[0030] (5)将重组质粒pEGEP-Nl-p53与MAR基因分别Xbal和Notl限制性内切酶双酶 切，纯化回收后25°C连接3h，得到连接产物pEGEP-Nl-p53/MAR;将连接产物pEGEP-Nl-p53/ MAR转化感受态细胞，培养，根据引物Primera、Primerb、Primerc、Primerd，挑取单菌落 进行PCR检测人抑癌基因p53和MAR基因，筛选出阳性菌落，提取连接产物pEGEP-Nl-p53/ MAR，进行酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序，酶切检测及测序正确的即 为表达载体pEGFP-Nl-p53/MAR;
[0031] 双酶切的反应体系为：重组质粒pEGEP_Nl_p53 3μL、BufferO1μL、灭菌去离子 水 13μL、Xbal和Notl各L5μL;30°C反应 4h;
[0032] 所述连接的体系为：MAR基因3yL、重组质粒pEGEP-Nl-p53 2yL、T4连接酶 0.5yL、10XT4DNALigaseBuffer3yL;加灭菌去离子水至总体积 20yL。
[0033] 所述上下游引物Primera、Primerb为：
[0034]Primera:5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'
[0035]Primerb:5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'
[0036] 所述上下游引物Primerc、Primerd为：
[0037]Primerc:5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'
[0038]Primerd:5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3' 〇
[0039]步骤（2)、（4)、（5)中的PCR检测的反应体系为：10XPCRBuffer3yL、dNTP Mixture2yL、菌落菌液1. 5yL、上下游引物各1yL、TaqDNA聚合酶0. 5yL，加灭菌去离子 水补充至总体积20μL;
[0040]步骤⑵、⑷和（5)中人抑癌基因p53的PCR检测的反应条件为：①94°C预变性 5min;②PCR扩增共40个循环：94°C预变性30s、60°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分 延伸lOmin;
[0041] 步骤（5)中MAR基因PCR检测的反应条件为：①94°C预变性5min;②PCR扩增共 40个循环：94°C预变性30s、54°C退火30s、72°C延伸90s;③72°C充分延伸lOmin。
[0042] 步骤（2)、（5)中的酶切鉴定的反应体系为：连接产物6μL、10XBufferK3μL、 灭菌去离子水8μL、HindIII和BamHI各1. 5μL，30°C反应4h;
[0043] 步骤（4)中的酶切鉴定的反应体系为：连接产物8yL、10XBufferK5yL、灭菌 去离子水 15μL、HindIII2μL，30°C反应 4h。
[0044] 步骤（5)中酶切后的重组质粒pEGEP-Nl-p53与MAR基因的纯化回收方法为：
[0045] (1)取 15μL重组质粒pEGFP-Nl-p53 的溶液，加入 3μL4mol/L的NaAc和 55μL 无水乙醇分析纯沉淀DNA;
[0046] 取MAR基因的PCR产物30μL，加入6μL4mol/L的NaAc和110μL的无水乙醇分 析纯沉淀DNA;
[0047] (2) 10000r/min离心5min，弃上清，在重组质粒pEGFP_Nl_p53和MAR基因中分别 加入100μL和150μL质量分数75 %的乙醇冲洗一次；
[0048] (3)重复步骤⑵一次；
[0049] (4) 10000r/min离心 5min，弃上清，室温下干燥 5-10min;
[0050] (5)向重组质粒pEGFP-Nl-p53和MAR基因的离心管中分别加入10yL和20yL的 灭菌