红缘拟层孔菌的固体发酵工艺及其抗肿瘤活性的制作方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明公开了红缘拟层孔菌的固体发酵工艺同时对其固体发酵产物进行了相应的抗 肿瘤活性研究，研究表明红缘拟层孔菌的固体发酵菌丝体中的3-乙酰氧基-8, 24-羊毛甾 二烯-21-酸的含量较高，发酵工艺较为简单，并且固体发酵产物具有良好的抗肿瘤活性。
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【背景技术】： 红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola (Sw.:Fr.)P. Karst·，又名"红缘层孔菌"等。隶 属于担子菌纲（Basidiomycetes)非裙菌目（Aphyllophorales)多孔菌科（Polyporaceae)， 拟层孔菌属（Fomes)。红缘拟层孔菌是世界性分布的木腐性真菌，它大多生长在阔叶树活立 木、针叶树、腐朽木以及倒木上，对很多种类的阔叶树木具有很强的危害性。红缘拟层孔菌 具祛风除湿，强心，解热，滋补强壮，扶正培本、补肺益肾，安神定志、和胃健脾等作用，对癌 症、心脏病、脑溢血、贫血、糖尿病、肾炎和支气管炎等疾病有很好的治疗效果。民间用其治 疗矿工的"寒腿"病。在中国东北长白山地区为常见种类，在春季、夏季和秋季均会出现。味 微苦、性平。有研究表明，红缘拟层孔菌提取物具有抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抑制肥胖、 保护肝脏、抑制水肿并能清除游离基、调节中枢神经系统、治疗糖尿病、增强人体免疫力。
[0003] 包海鹰课题组研究表明，红缘拟层孔菌子实体氯仿提取物的有效成分3-乙酰 氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸具有良好的抗肿瘤活性，其抑瘤率达到52.97%。因此， 研究其最佳发酵条件具有良好的应用前景。目前在已对其液体发酵工艺研究的基础上，考 虑其生产成本，进一步研究了其固体发酵工艺。为红缘拟层孔菌开发利用，投入市场提供研 究基础。
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【发明内容】
： 本发明公开了红缘拟层孔菌固体发酵的方法及最佳条件，同时证明了其具有良好的抗 肿瘤活性。
[0005] 1 材料 1. 1实验材料 红缘拟层孔菌菌种：红缘拟层孔菌Fomitopsispinicola采自长白山，由吉林农业大 学图力古尔教授鉴定为红缘拟层孔菌，菌种由经鉴定后的红缘拟层孔菌子实体中采用组织 分离法得到。
[0006] 1. 2实验试剂及药品 环磷酰胺（CTX，山西普德药业有限公司）购于吉林省肿瘤医院，二氯甲烷、石油醚，甲醇 为分析纯(北京化工厂)，乙腈为色谱纯(北京化工厂)。
[0007] 1. 3主要仪器 电子分析天平（SHIMADZUAUY220型）；高效液相色谱仪（AgilentTechnologies1100) 1. 4实验动物 昆明小鼠60只，雌性，20±2g，（吉林大学实验动物中心）腹水型H22荷瘤小鼠（吉林省 肿瘤医院） 2固体发酵培养基的筛选 2. 1溶液的配制 营养液配制：葡萄糖1%，蛋白胨1%，磷酸二氢钾0. 2%，柠檬酸铵0. 1%，硫酸镁0. 05%，VBllOmg/lOOOml。按上述比例加入沸水中，最后定容至1000ml。
[0008] 液体培养基的配制：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸20到 30分钟，能被戳破即可)，用四层纱布过滤，加20g葡萄糖，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再 补足水分至1000毫升。
[0009] 2. 2液体菌种的制备 用接种环将红缘拟层孔菌母种斜面培养基上的菌丝接在两个250ml摇瓶内，每个摇瓶 装有液体培养基l〇〇ml，置于28°C的恒温振荡器中，转速130r/min，PH自然，培养10天后作 为液体菌种。
[0010] 2.3培养基的组成 本文以9种培养基为基础培养基进行初步培养基的筛选，各培养基的组成如下： 1大米+水；2大米+营养液；3大米+牛奶；4玉米+水；5玉米+营养液；6玉米+牛 奶；7炒米+水；8炒米+营养液；9炒米+牛奶。
[0011] 先将大米、玉米、炒米用清水进行浸泡，24h后取出，浙干后，分别称取20g大米、玉 米和炒米放入锥心瓶中，按上述标号加入25ml相应的溶液，使其湿度保持在50%-60%。
[0012] 2.4固体培养基的培养及其处理 将各固体培养基及注射器、玻璃皿在121°C下灭菌30min，在超净工作台中进行接菌， 每个锥心瓶中接菌lml液体菌种，然后放入培养箱中与25°C，湿度40%，无光照条件下培养 15天，取出，最后于40°C下烘干。
[0013] 将烘干后的固体培养基进行精密称重，然后加5倍量石油醚超声提取30min进行 脱脂，过滤，取滤渣，用5倍量二氯甲烷超声提取30min，过滤，取滤液，重复2次，合并滤液， 浓缩干燥后溶于l〇ml甲醇，过微孔滤膜后，取10ul进行HPLC检测，检测其中3-乙酰氧 基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量。
[0014] 2. 5标准溶液的配制 取5mg 3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸单体化合物，置于5ml容量瓶中，加入甲醇，定容至5ml，制备成lmg/ml的标准品溶液。取标准品10ul进行HPLC进行检测。
[0015] 2.6色谱条件 色谱柱：Amethyst C18_P，4. 6X150nm，粒径：10um。流动相：乙腈：水（90:10);柱温：25°C ;流速：0· 8ml/min ;检测波长：242nm。
[0016] 3.结果与结论 各固体培养基中的3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量结果见表1，结果表 明9号培养基中3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量最高，因此，以3-乙酰氧 基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量为指标，最终选用20g炒米，加入25ml牛奶的培养基 为最佳培养基。
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3.抗肿瘤活性的研究 3. 1供试药品的制备 红缘拟层孔菌发酵培养基：采用上述9号培养基配方，培养15天后取出，45°C烘干， 粉碎。对其采用HPLC检测其中3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量，结果为 0.046mg/g〇
[0018] 固体发酵溶液的制备：取红缘拟层孔菌的干燥发酵培养基，溶于生理盐水中，配制 成低、中、高（200mg/kg/d、400mg/kg/d、600mg/kg/d)三种剂量。
[0019] 阳性药的制备：取环磷酰胺，用生理盐水制备成剂量为20mg/kg/d的溶液。
[0020] 3. 2鼠模型的制备 取接种7d，生长状况良好的腹水型H22荷瘤小鼠，脱颈椎处死后，无菌抽取腹腔瘤液， 然后用生理盐水稀释至浓度为1X106个/ml的细胞悬液，接种于小鼠左下肢腹股沟处，每 只 0.lml。
[0021 ] 3. 3实验分组及给药方法 将接种后的小鼠随机分为5组，每组10只，即阳性对照组、阴性对照组和实验组，实验 组又分为低、中、高剂量组。接种24h小时后，实验低、中、高剂量组分别灌服对应剂量的发 酵培养基溶液，阴性组灌服生理盐水；连续给药l〇d，阳性组按剂量20mg/kg给药环磷酰胺， 隔天给药；再取10只没有接瘤的小鼠正常饲养作为空白对照组。室温下自由给食水。
[0022] 3. 4实验处理方法 每天观察各组小鼠的生存状态并称重。在处死小鼠前12h停止喂食，自由饮水，将小鼠 处死后，完整摘取小鼠的瘤块、胸腺和脾脏，并分别称重，计算抑瘤率和器官免疫指数(脾脏 指数和胸腺指数)。
[0023] 3. 5数据统计及分析 肿瘤的抑制率=(对照组的平均瘤重一给药组的平均瘤重)/对照组的平均瘤重X100%。 胸腺指数=胸腺重量(mg) /体重（g)，脾脏指数=脾脏重量(mg) /体重（g)。实验数据用 冑表示，并采用SPSS18. 0forWindows统计软件分析。P< 0. 05说明在统计学上呈显 著差异，P< 0. 01说明在统计学上呈极显著差异。
[0024] 3. 1. 2结果与分析 表2红缘拟层孔菌固体发酵产物对H22荷瘤小鼠肿瘤的影响
实验结果(表2)可知，菌丝体中剂量的抑瘤率为63. 4%，与阳性组相当，但其低剂量和 高剂量均低于阳性对照组，表明其在400mg/kg/d剂量时抗肿瘤效果最好。
[0025] 表3红缘拟层孔菌固体发酵产物对H22荷瘤小鼠肿瘤的影响
注：与正常组相比：*P〈〇. 05，#p〈0. 01;与阴性组相比：ΛΡ〈0. 05，ΛΛΡ〈0. 01;与阳 性组相比：#Ρ〈〇· 05, ##Ρ〈0· 01. 实验结果(表3)表明，菌丝体中剂量的脾指数为11. 98,与阴性对照组的8. 43相比具有 极显著性差异（Ρ〈〇. 01 )，与正常组的8. 29相比具有极显著性差异（Ρ〈0. 01);菌丝体高剂量 组的脾指数为12. 86,与正常组额8. 29相比具有极显著性差异（Ρ〈0. 01)，与阴性组的8. 43 相比具有极显著性差异（Ρ〈〇. 01)，与阳性对照组的9. 6相比具有极显著性差异（Ρ〈0. 01)。
[0026] 菌丝体低剂量组的胸腺指数为2. 61，与正常组的3. 78相比具有显著性差异 (Ρ〈0. 05);菌丝体中剂量的胸腺指数为3. 72,与阳性对照组的2. 61相比具有显著性差 异（Ρ〈0. 05);菌丝体高剂量的胸腺指数为4. 62,与正常组的3. 78相比具有极显著性差异 (Ρ〈0. 01)，与阴性对照组的3. 14相比具有极显著性差异（Ρ〈0. 01)，与阳性对照组的2. 61相 比具有极显著性差异（Ρ〈〇. 01)。
[0027] 4 讨论 红缘拟层孔菌是一种具有良好抗肿瘤活性的药用真菌，3-乙酰氧基-8, 24-羊毛甾 二烯-21-酸是其抗肿瘤的有效成分，本实验室以对其化学结构，药理活性及其作用机制 做了初步的研究，还对其液体发酵工艺及初步大量生产的研究，但考虑其生产成本，现研 究其固体发酵工艺。结果表明红缘拟层孔菌的固体发酵菌丝体也含有大量的3-乙酰氧 基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸，并且其发酵工艺较为简单。其次对固体发酵产物进行了相 应抗肿瘤的研究，结果表明固体发酵产物在剂量为400mg/kg时同样具有良好的抗肿瘤活 性。对小鼠脾指数的影响，固体发酵产物中剂量、高剂量与空白组和阴性组相比具有极显著 性差异；对胸腺指数的影响，固体发酵产物高剂量与阴性对照组、阳性对照组相比具有极显 著性差异。对3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸抗肿瘤的具体机制需进一步深入系 统的研究，为红缘拟层孔菌投入市场奠定坚实的理论基础。
【主权项】
1. 红缘拟层孔菌的固体发酵的最佳工艺条件：20g炒米(炒米是蒙古族传统的食物，是 由糜子米aziJiace·var.compactrm炒熟后碾去外壳而得的米粒)，加入25ml牛 奶，温度25°C，湿度40%，无光照条件下培养15天，取出，最后于40°C下烘干；发酵产物中有 效成分3-乙酰氧基-8, 24-羊毛留二烯-21-酸的含量为0· 037mg/g。2. 根据权利要求1所述发酵工艺得到的固体发酵产物具有良好的抗肿瘤活性。
【专利摘要】本发明公开了红缘拟层孔菌的最佳固体发酵工艺同时对其固体发酵产物进行了相应的抗肿瘤活性研究，得到结果最佳培养基为20g炒米（炒米是蒙古族传统的食物，是由糜子米Panicummiliaceumvar.compactrm炒熟后碾去外壳而得的米粒），加入25ml牛奶的培养基,培养条件为温度25℃，湿度40%，无光照条件下培养15天，取出，最后于40℃下烘干。3-乙酰氧基-8,24-羊毛甾二烯-21-酸在发酵产物中的含量为大于0.037mg/g。固体发酵产物在剂量为400mg/kg时具有良好的抗肿瘤活性。对小鼠脾指数的影响，固体发酵产物中剂量400mg/kg、高剂量600mg/kg与空白组和阴性组相比具有极显著性差异；对胸腺指数的影响，固体发酵产物高剂量与阴性对照组、阳性对照组相比具有极显著性差异。
【IPC分类】C12R1/645, A61K36/07, A61P35/00, C12P33/00
【公开号】CN105274175
【申请号】CN201410356156
【发明人】包海鹰, 图力古尔, 黄威
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月25日