一种检测cyp3a4*1g和mdr1c1236t的基因多态性的hrm方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和医学领域，涉及与药物动力学相关的基因检测。尤其涉及 一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的HRM方法。利用本发明的方法，一次 可完成大量样本的快速检测，方法简便，准确可靠省时省力，为临床个体化合理用药提供方 便。
【背景技术】
[0002] 高分辨率熔解曲线分析技术（HighResolutionMelting)，简称HRM，是由美国犹 他大学和爱德华科技公司合作开发的一种SNP以及突变研究的工具，能检测人类84%的 SNP(单核苷酸多态性）。HRM基于核酸分子物理性质的不同影响解链温度，通过实时检测升 温过程中饱和荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，从荧光强度和时间曲线上判断是否存 在SNP。核苷酸双链的热稳定性受碱基组成、长度和GC含量的影响，序列改变会引起升温过 程DNA解链行为的改变。SNP位点若不匹配会使双链DNA在升温过程中解链，荧光染料从局 部解链的DNA分子上释放，仪器获得的荧光信号将会减弱。不同SNP位点、杂合子与纯合子 等都会影响熔解曲线的峰型，进而有效区分不同基因型。应用HRM曲线对样品进行分析，极 高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到单个碱基差异的区分。单个碱基引起的解链 温度差异可能不到1°C，HRM具有很高的温度分辨率，可以每步升温0. 02~0. 1°C，每升高 一摄氏度采集荧光25次，可满足单碱基差异的区分。HRM基于高效稳健的PCR技术，不受突 变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行HRM即可完成对样品 突变、SNP、甲基化等的分析。
[0003] HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和荧光染料，根据荧光信号强度的微妙变 化来判断基因类别，有着很高的灵敏度和准确度。相对于非饱和染料，饱和染料具有更强的 DNA结合作用和较小的PCR抑制作用，使得DNA在解链过程中不会发生重排，熔解曲线有更 高的分辨率。近年来在HRM中应用较多的饱和染料有LCGreen、LCGreenPlus、EvaGreen 和SYT0-9。
[0004] 基因指导下的个体化用药越来越受到重视，20%~95%的药物反应和处置的个体 差异是由遗传因素引起的。基因多态性的存在可能导致治疗中不同患者的疗效和不良反应 的差异，许多科学家认为编码药物代谢酶、药物转运体和药物作用。
[0005] 靶点的基因序列的不同是引起同一种药物相似剂量在不同个体间产生不同反应 的主要原因。FDA和欧洲EMEA分别于2005年和2010年颁布或起草了关于新药临床试验中 提供药物基因组学数据的指导文件。
[0006] CYP3A4是CYP3A家族中一个高表达的亚族酶系，CYP3A4*1G在亚洲人的 变异频率较高。CYP3A4*1G位于CYP3A4内含子10,造成82266位置G到A的取代 (20230G>A，rs2242480)，有研究报道CYP3A4*1G的表达对CNI类免疫抑制剂如环孢素和他 克莫司的药动学有影响。
[0007] P-gp是MDR1编码的ATP依赖的跨膜受体，通过在肠道的外排泵活性阻碍环境 毒素和药物等外源物质的吸收，保护敏感组织及作用底物的排泄，因此会造成药物处置 和相互作用上的差异，进而影响到药物的疗效和不良反应。目前已研究了 95个MDR1位 点，其中有74个位点具有多态性，研究较多的位点有MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T等。 C1236T(rsll28503)位点位于第12个外显子，其变异属于不引起氨基酸变化的同义突变。
[0008] SNP的主要检测方法有以凝胶电泳为基础的传统经典法和近些年来发展起来的高 通量、自动化程度较高的测序法，如限制性片段长度多态性法（RFLP)、单链构象多态性法、 变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、DNA直接测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪检测、 变性高效液相色谱法等。目前普遍应用的基因突变检测方法有RFLP法和DNA直接测序法。 RFLP法将PCR与限制性酶切相结合，因其实验操作繁琐、检测周期较长、第一轮酶切不完全 导致假阳性结果以及只能用于已知SNP的判断，无酶切位点的不能检测等因素，只适合少 量样本的检测。变性梯度电泳法有商品化的电泳装置，适合大样本检测筛选，但因为该法是 利用温度和梯度凝胶迁移率来进行检测的，需要进行凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人 工假相，导致结果出现偏差。DNA直接测序法中PCR产物在全自动测序仪上电泳后进行测 序，方法先进，但是工作量大，耗时较长，价格昂贵，不适合大样本的检测。
[0009] 从临床检测效率、准确性以及病患经济条件出发，理想的SNP分析方法应该具备 简单快速、灵敏准确、经济实用的特点，近些年发展起来的HRM可以满足。HRM分析技术以快 速的操作方法获得需要的基因信息，满足临床个体化用药的时效性和经济性要求，为临床 合理用药提供帮助。
【发明内容】
[0010] 本发明主要目的在于提供一种检测与药物动力学相关的基因的检测方法，尤其涉 及一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多态性的简便快速方法。本发明涉及的HRM曲线 法灵敏度高、特异性好、方法简单且能实现高通量筛选，操作不需要进行酶切、纯化等步骤， 避免人工接触有毒有害试剂和紫外照射等，安全性较好，并且能实现闭管操作，降低样本污 染，分析不需要探针，仅在PCR反应体系中增加微量饱和荧光染料，成本较低。
[0011] 具体的，本发明提供了一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多态性的方法，所 述的方法是在高分辨率熔解曲线分析技术基础上，针对目的基因的检测位点，筛选特异性 引物对和检测反应条件，完成目的基因的检测；
[0012] 所述的目的基因的检测位点是CYP3A4*1G和MDR1C1236T。
[0013] 所述方法包含以下步骤：
[0014] (1)查找目的基因的DNA序列；
[0015] (2)针对目的基因的突变位点设计筛选特异性引物对；
[0016] (3)提取样本DNA，利用步骤（2)筛选的特异性引物进行基因扩增；
[0017] (4)琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增；
[0018] (5)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，选用 DNA饱和染料，参照对照样本HRM曲线完成对样本基因型的判断。
[0019] 优选的，所述引物对含有目的基因靶序列中18-27个连续的核苷酸构成的连续核 苷酸序列。
[0020] 优选的，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括引物、DNA聚合 酶、dNTPs、Mgcl2、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料。
[0021] 在本发明的一个优选实施例中，选用的TaKaRaPremixTaq试剂盒包含Taq?HS、 PCR缓冲液（含Mg2+)、dNTPs。
[0022] 所述PCR反应体系终浓度组成为：
[0023]
[0024] 所述dNTPs混合液包括 0· 4mMdATP、0. 4mMdTTP、0. 4mMdGTP、0. 4mMdCTP的混合 液。
[0025] 优选的，所述的20μLPCR反应体系各组分体积：
[0026]
[0027] 优选的，所述荧光染料为DNA饱和染料SYT0-9。
[0028] 优选的，所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为95°C预变性10min，95°C 变性30s，50-65°C退火30s，72°C延伸30s，72°C继续延伸5min，40个循环。
[0029] 优选的，所述琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增，梯度PCR选择目 的基因扩增产物退火温度分别为，CYP3A4*1G:57°C，MDR1C1236T:60°C。
[0030] 优选的，所述HRM曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测。所述进行突 变位点检测的产物熔解程序中进行产物熔解检测的条件为95°C变性2min，40°C复性2min; 然后初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信 号，25-45次每秒；然后40°C进行冷却10s。熔解曲线温度设定范围分别：CYP3A4*1G为79~ 88°C，MDR1C1236T为 80 ~88°C。
[0031] 优选的，所述方法具体按照如下步骤进行：
[0032] 1)查找目的基因CYP3A4*1G和MDR1C1236T的DNA序列；
[0033] 2)针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；
[0034] 3)提取样本DNA，利用步骤⑵筛选的引物进行基因扩增；
[0035] 4)琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增；
[0036] 5)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，选用 SYT0-9饱和荧光染料，参照对照样本HRM曲线完成对样本基因型的判断。
[0037] 优选的，所述模板DNA从健康人全血样本中提取。<