测定人PON1基因rs662位点多态性的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] SNP(单核苷酸多态性）是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基 的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生倶来的遗传特征，不随环境发生变化， 也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
[0003] 基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起 源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史， 阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关 系。2.研究多态与种群未缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身 高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体 对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触， 保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出 现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物 侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某 种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效 果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。
[0004] 对氧磷酶1 (paraoxonasel, P0N1)基因位于染色体7q21. 3,该基因编码的是一种 广谱非专一性酯酶，其表达产物在体内广泛分布，能水解对氮磷类有机磷化合物和高密度 脂蛋白上的氧化型磷脂。P0N1基因rs662位点多态，在人群中存在两种等位基因A和G，形 成三种P0N1基因的基因型：AA型（人体基因组rs662多态位点的两个等位基因碱基均为 A)，AG型（人体基因组rs662多态位点的两个等位基因碱基分别为A和G)和GG型（人体 基因组rs662多态位点的两个等位基因碱基均为G)。
[0005] 聚合酶链式反应-限制性片断长度多态（PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准 确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性）基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行 扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片 段长度，最终测定出SNP。P0N1基因rs662多态位点采取PCR-RFLP技术进行检测，所需内 切酶为Sau3AI，BfuCI，Alwl，Mbol，DpnII等，其价格较昂贵，因此需要开发新的检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人P0N1基因rs662位 点多态性的可靠手段。
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了一种测定人P0N1基因rs662位点多态性的方法， 包括：
[0008] 提供待测人基因组DNA;
[0009] 提供扩增人P0N1基因rs662位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物 具有错配喊基A;
[0010] 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以 获得含RATTC片段或者RATT片段的扩增产物，其中R为人P0N1基因序列上的待定碱基A 或G;
[0011] 提供限制性内切酶；
[0012] 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切（反应）以获得相应的酶切产物；以 及
[0013] 根据所得酶切产物来确定人P0N1基因rs662位点上的待定碱基R是A还是G，其 中，限制性内切酶为仅能够切开GATTC片段与AATTC片段之一，或者切开GATT片段与AATT 片段之一的限制性内切酶。
[0014] 根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基A与R的互补碱基 之间相隔两个碱基AT。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极其顺利，不 会出现酶切不充分等现象。并且，如此设置下游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了 PCR的灵敏度和特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。
[0015] 在本发明的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与多态位 点R的互补碱基相邻。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基不与多态 位点R的互补碱基相邻。例如，下游引物末端可以是……AA等结构。难以想象，具有这种 设计的下游引物竟然会进一步大大促进酶切反应，这可能与扩增结合力有某种关联。
[0017] 在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开GATTC片段的 Hinfl或其同裂酶。这类Hinfl酶价格低廉，能大大降低测定成本。
[0018] 根据本发明的实施例，所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长度的未切 断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产物（较短 片段通常不能有效观测到）。通过观测（判断）酶切产物所包含的片段类型来确定人P0N1 基因rs662位点上的待定碱基是A还是G。例如，在采用Hinfl酶的情况下，根据总片段和 切断后较长片段这两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具有总 片段长度的未切断扩增产物，则待定碱基为A;如果观察到酶切产物只有一种具有较长片 段（小于总片段长度）的切断产物，则待定碱基为G;如果观察到上述二者，则待定碱基既 包括A又包括G。
[0019] 在本发明的一个实施例中，判断（或观测）酶切产物所包含的片段类型是通过凝 胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。这种情况下，优选参照图是扩增产物在 凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图 像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图 像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本发明采用的参照图是由合成 的197bp和157bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNA ladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的 这种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了 误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1~2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断 准确性。
[0020] 在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产 物的总片段长度在l〇〇bp至300bp之间，并且下游引物的片段长度至少为35bp，优选长度 40~60bp(在该优选区间扩增反应尤其顺利充分），使得酶切切掉部分片段长度占总片段 长度的百分比超过20%。本发明的这种设计可以使得具有总片段长度的未切断扩增产物 与切断后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位置区别显著。但是，如果总片段过 长，则电泳位移将不明显；过短则图像会变得模糊一片，无法准确区分。下游引物的片段长 度范围保证了PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足现象。
[0021] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火温度的范围在55~70°C 之间，优选温度60~69°C(该温度可提高扩增反应的特异性），使得设计的PCR产物纯度 较高。本发明的这种设计可以使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳切开。但 是，如果温度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难以区分判断；如果温度过高，则影响 PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效果。
[0022] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在10~60s 之间，优选时间15~30s(该时间可提高扩增反应的效率和扩增产物的特异性），使得设计 的PCR反应时间较短，扩增产物纯度较高。本发明的这种设计可以使PCR扩增产物条带清 楚，无杂带出现，易于电泳切开，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，则特异条带不能 完全扩