基于AgNCs/HpDNA探针的microRNA SDA检测法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学和分子诊断领域，是一种基于AgNCs/HpDNA探针的microRNASDA 检测法，特别是涉及一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇探针结合链取代等温扩增的 单个microRNA检测方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码小RNA分子，其可通过与 mRNA之间精确或非精确互补配对，参与调控mRNA的表达水平。多个miRNA可协同调控一个 mRNA，或一个miRNA也可同时影响多个靶基因，从而形成一个高度复杂的调控网络，影响着 从分子到细胞再到组织水平的一系列生物功能。miRNA表达异常与疾病及癌症发生密切相 关。尤为重要的是，已发现多种miRNA标志物可用于癌症早期诊断、预后及进程监控。其中， 上海交通大学崔大祥课题组用微阵列芯片miRNA全基因组扫描结合qRT-PCR技术筛选得到 miR-16-5p和miR-19b-3p两种血衆miRNA标志物，并指出二者可用于指示胃癌发生发展进 (Zhang,J. ,Song,Y. ,Zhang,C. ,etal. (2015)CirculatingmiR-16_5pandmiR-19b_3p astwonovelpotentialbiomarkerstoindicateprogressionofgastriccancer. Theranostics，5, 733-745.)。其中，qRT-PCR是进行miRNA定量检测的金标准，但由于其需 分步进行逆转录和热循环扩增及检测，导致该法耗时且费力。所以仍有必要进一步发展便 捷快速的miRNA检测新方法。
[0003] 等温扩增技术的出现使核酸扩增技术因摆脱了热循环变性步骤和仪器的束缚，而 受到了众多研究者的关注。作为第一代等温扩增技术，链取代扩增Strand-displacement amplification(SDA)受DNA修复中碱基切除修复机制的启发迅速发展起来，至今，已发展 出包括多引物SDA(multiplyprimedSDA)，剪切诱导SDA(nicking_initiatedSDA)，环介 导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification(LAMP))和结构转换诱发SDA(st ructure-switching-triggeredSDA)等多种亚型。其中，由于结构转换诱发SDA不需要特 殊设计剪切位点和额外使用剪切酶，而仅通过待测靶核酸与发夹结构探针的结合并导致后 者打开而诱导SDA反应，特别适合对短链核酸分子及miRNA进行检测。目前，常用于结构转 换诱发SDA的检测探针是一端连接有荧光染料及另一端连接荧光淬灭子的发夹型DNA分子 信标（molecularbeacon(MB))，但由于其需要对DNA进行偶联修饰，使检测成本增高，检测 应用受限。
[0004]随着以DNA模板合成银纳米团族（DNA-templatedsilvernanoclusters(AgNCs/ DNA))的兴起，使得可能发展出除荧光染料或量子点修饰以外的新型核酸荧光探针。银 纳米团簇是仅由几个或几十个银原子组成的直径小于lnm的集合体，其易于合成，且荧 光可调控。更重要的是，AgNCs/DNA中由于DNA模板的引入，可仅通过改变DNA序列、长 度和构象来获得特定的光物理学特性。近来，已有多种DNA序列合成AgNCs用于核酸或 miRNA检测。Yang和Shah以 5' -CCTCCTTCCTCC-3' 为AgNCs成核区序列，并连接以miRNA 杂交序列，借助该探针的荧光淬灭效应，对miR-160和miR-172进行了检测（Yang，S. ff.andVosch,T. (2011)RapiddetectionofmicroRNAbyasilvernanocluster DNAprobe.Anal.Chem. , 83, 6935-6939.)。Liu利用指数等温扩增反应生成用于红色 荧光AgNCs合成的DNA模板，并借助荧光强度与DNA模板浓度间关系，对miR-141进行 了测定。这些检测或借助荧光淬灭效应，或分别进行信号扩增和信号检测，导致特异 性不好，或操作繁琐（Liu,Y. -Q.，Zhang,M.，Yin,B. -C.andYe,B. -C. (2012)Attomolar ultrasensitivemicroRNAdetectionbyDNA-scaffoldedsilver-nanoclusterprobe basedonisothermalamplification.Anal.Chem.，84, 5165-5169.)。而随着Yeh报道 了杂交介导的富G序列对AgNCs/DNA的荧光增强效应，使建立基于1ight-up信号的核 酸检测平台成为可能（Yeh,H.C.，Sharma,J.，Han,J.J.，Martinez,J.S.andWerner,J. H. (2010)ADNA-silvernanoclusterprobethatfluorescesuponhybridization.Nano Lett.，10, 3106-3110.)。但是，单纯的杂交检测虽然简便，却也很难确保较好的特异性。因 而，为进一步提高检测特异性，简化操作步骤，我们首次将基于AgNCs/DNA的富G序列荧光 增强效应与结构转换诱发SDA扩增技术结合，并研究二者的相互作用，以期实现可调控、简 便及高特异检测。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于AgNCs/HpDNA探针 的miRNASDA检测法，具体是一种基于发夹型DNA模板合成银纳米团簇（AgNCs/HpDNA)探针 结合SDA反应对miRNA进行检测的方法，即针对前期筛选得到的miRNA标志物miR-16-5p， 设计并构建AgNCs/HpDNA探针，验证该探针的富G序列荧光增强性能，在此基础上，对该 miRNA标志物进行单个检测，及单个碱基错配检测。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种HpDNA，序列如SEQIDN0 :1所示。
[0008] 第二方面，本发明提供一种所述HpDNA的AgNCs/HpDNA，所述AgNCs/HpDNA是通过 如下方法制备：
[0009] 将AgN03溶液、NaBH4溶液加入HpDNA中，震荡，静置，即得AgNCs/HpDNA。
[0010] 优选地，HpDNA、AgN03、NaBH4的终摩尔浓度之比为1:25:25 ;所述震荡为剧烈震荡， 剧烈震荡的时间为45s-lmin;所述静置具体指于暗环境中室温放置18h。
[0011] 第三方面，本发明提供一种所述的AgNCs/HpDNA在检测胃癌血浆miRNA标志物 miR-16-5p中的应用，所述miR-16-5p的序列如SEQIDN0 :2所示。
[0012] 第四方面，本发明提供一种基于所述AgNCs/HpDNA的胃癌血浆miRNA标志物 miR-16-5pSDA检测方法，所述检测方法包括：以所述AgNCs/HpDNAs为分子探针，在含富G 序列垂悬端的引物作用下进行SDA反应，借助富G序列杂交荧光增强效应，实现miR-16-5p 检测，所述引物序列如SEQIDNO:3所示。
[0013] 优选地，所述SDA反应的总体积为50μL，其中，
[0014]
[0015] 余量为无酶水。
[0016] 优选地，所述缓冲液lXNb2. 1 包括 50mMNaAc、10mMTris-HAc、10mMMg(Ac)jP 100μg/mLBSA，缓冲液pH7· 9 (25°C)。
[0017] 优选地，所述SDA反应的反应条件为55°C环境中孵育55min，荧光检测的激发波长 为 580nm。
[0018] 第五方面，本发明提供一种所述的检测方法在单个碱基错配核酸序列检测中的应 用。
[0019] 本发明所采用的技术方案是：
[0020] 如图1所示，用于合成AgNCs的发夹型探针（RED16(7s)C)含三个区，分别为颈区 HpS、环区HpL和3'垂悬区HpRO。其中，特别设计的垂悬区富含C序列用于合成AgNCs，且 HpR0(5' -CCCTTAATCCCC-3'）在杂交作用下与互补链中的富G垂悬序列靠近而得到红色荧 光增强信号。用于miR-16-5p检测的探针为RED16(7s)C，其序列如SEQIDN0:1所示。
[0021] 而待测miRNA序列分别与5'端颈部HpS部分序列及环区HpL互补，对应序列区域 分别为MSc和MLc，该设计有利于更好地打开发夹结构，相应的靶miRNA为miR-16-5p，其序 列如SEQIDN0 :2所示。
[0022] 引物序列也由两个区域组成，分别为颈区互补区（PRSc，5'-TA-3'）和富G序列垂 悬区（P0:5' -GGGTGGGGTGGGGTGGGG-3'），相应HpDNA的引物为Pri2,其序列如SEQIDN0 : 3所示。
[0023] miRNA的检测机制如下。首先，在发夹型探针上生成AgNCs，AgNCs/RED16 (7s)C探 针在580nm波长激发下无荧光发射或较弱。在有靶miRNA时，其通过与AgNCs/HpDNA杂交， 而打开发夹结构。随后，引物杂交至发夹探针颈部3'端，在聚合酶和dNTP的共同作用下， 引导聚合酶链反应，延伸得到HpDNA的互补链HpDNAc(RED16 (7s)G，其序列如SEQIDN0 : 4所示），从而使杂交双链AgNCs/HpDNA-HpDNAc中富G垂悬互补序列与AgNCs靠近，并得到 位于该波长处的探针的荧光增强信号。同时，先前与HpDNA结合的靶miRNA序列被取代并 释放，进入下一个循环反应。相反，在没有靶miRNA时，HpDNA保持闭合状态，引物无法结合， 进而也无法扩增生成HpDNAc，最终，无法获得该波长处的荧光增强信号。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0025] 第一，基于AgNCs/HpDNA探针及其富G序列荧光增强效应，可实现miRNA的高特异 性检测。相比SYBRGreen随意插入双链核酸，及MB只要发夹探针打开即可产生荧光信号 响应的机制，本发明所用探针仅在形成带富G垂悬序列的互补序列并与之杂交后，才会生 成荧光增强信号，发夹探针打开及任何中间体杂交双链均不会产生该信号，因而具有高特 异性。
[0026] 第二，发夹型DNA既作为SDA反应的模板，又作为AgNCs的生成模板，缩短了反应 时间并节省了反应材料。通过将AgN(V^NaBHj$照一定比例与发夹型DNA混合，S卩可制备 得到AgNCs/HpDNA探针。尽管该探针需要静置18h以使AgNCs充分老化，但其可以一次性 大量制备并长期储存，且静置时间也可缩短至4h。在此基础上，SDA反应时间仅一步完成， 时长55min，也可进一步缩短至30min。
【附图说明】
[0027] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0028] 图1为检测原理不意图；
[0029] 其中，①HpDNA模板上生成AgNCs;②靶miRNA杂交互补于HpDNA的5'颈区和环 区；③HpDNA打开；④富G垂悬引物结合于HpDNA3'颈区；⑤在聚合酶作用下延伸形成富G 垂悬互补链HpDNAc;⑥祀miRNA释放，进入下一循环SDA反应；
[0030] 图2为富G序列杂交荧光增强效应验证；其中，
[0031] A :AgNCs/RED 16 (7s) C探针及其杂交产物荧光发射谱；
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