一种鉴定光慈菇的方法及其专用引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定光慈菇的方法及其专用引物对。
【背景技术】
[0002] 光慈燕（BulbusTulipae)为百合科（Liliaceae)植物老鸦瓣（Amanaedulis) 除去膜质皮及绒毛后的干燥鳞茎，具有解毒散结、行血化瘀的功效，主治咽喉肿痛、瘰疬、痈 疽、疮肿和产后瘀滞等。近年来研究表明，光慈菇对于乳腺疾病的治疗具有显著的效果，因 此导致光慈菇需求量的增加。但光慈菇主要来源于野生，其野生资源逐步匮乏，导致了伪品 的出现与混用，妨碍了临床用药的准确性。为了保证临床用药的安全性和有效性，需要对光 慈菇及伪品进行鉴别。
[0003] 光慈菇及其混淆品主要依据外部形态、显微特征、薄层色谱法、紫外光谱吸收特征 和液相色谱等方法进行鉴别。这些方法中有的分辨率不高，有的方法复杂费时，不利于推 广，因此迫切需要建立快捷、简便的鉴定光慈菇的方法，以保障光慈菇临床用药的安全。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题如何快速、简便的鉴定光慈菇。
[0005] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对，可由引物LYB-CP20S和引物 LYB-CP20a组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列 2〇
[0007] 上述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对中，所述引物LYB-CP20S和引物 LYB-CP20a的摩尔比可为1:1。
[0008] 上述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对的应用，为如下al)_al2)中任一种：
[0009] al)制备用于检测或辅助检测光慈菇的试剂盒；
[0010] a2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有光慈菇；
[0011] a3)制备用于鉴定或辅助鉴定光慈菇的试剂盒；
[0012] a4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为光慈菇；
[0013] a5)制备用于鉴定或辅助鉴定市售光慈菇的真伪性的试剂盒；
[0014] a6)鉴定或辅助鉴定市售光慈菇的真伪性；
[0015] a7)制备用于检测或辅助检测老鸦瓣的试剂盒；
[0016] a8)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有老鸦瓣；
[0017] a9)制备用于鉴定或辅助鉴定老鸦瓣的试剂盒；
[0018] alO)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为老鸦瓣；
[0019] all)制备用于鉴定或辅助鉴定市售老鸦瓣的真伪性的试剂盒；
[0020] al2)鉴定或辅助鉴定市售老鸦瓣的真伪性。
[0021] 本发明还提供了用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定光 慈菇或老鸦瓣的试剂盒含有上述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对。
[0022] 本发明还保护上述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的试剂盒的制备方法，可包括将上述 用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对的各引物分别单独包装的步骤。
[0023] 上述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用 于鉴定光慈菇或老鸦瓣的试剂盒的应用为如下bl)或b2)或b3):
[0024] bl)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有光慈菇或老鸦瓣；
[0025] b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为光慈菇或老鸦瓣；
[0026] b3)鉴定或辅助鉴定市售光慈菇或老鸦瓣的真伪性。
[0027] 本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有光慈菇的方法，可包括如 下步骤：提取待测样品的总DNA，采用上述任一所述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对进 行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有光慈菇；如果不能 实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有光慈菇。所述待测样品可为中药材， 或，所述中药材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
[0028] 本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为光慈菇的方法，可包括如下步 骤：提取待测样品的基因组DNA，采用上述任一所述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对进 行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为光慈菇；如果不能实现有 效扩增，则所述待测样品不为或候选不为光慈菇。所述待测样品可为中药材，或，所述中药 材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
[0029] 本发明还提供了一种鉴定市售光慈菇的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市 售光慈菇的基因组DNA，采用上述任一所述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对进行PCR扩 增，如果能够实现有效扩增，则所述市售光慈菇为或候选为真品；如果不能实现有效扩增， 则所述市售光慈菇为或候选为伪品。
[0030] 本发明还提供了一种鉴定市售老鸦瓣的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市 售老鸦瓣的基因组DNA，采用上述任一所述用于鉴定光慈菇或老鸦瓣的引物对进行PCR扩 增，如果能够实现有效扩增，则所述市售老鸦瓣为或候选为真品；如果不能实现有效扩增， 则所述市售老鸦瓣为或候选为伪品。
[0031] 上述任一所述方法中，所述"能够实现有效扩增"可为所述PCR扩增产物中含有 400-500bp的DNA片段。
[0032] 上述任一所述方法中，所述"不能实现有效扩增"可为所述PCR扩增产物中不含有 400-500bp的DNA片段。
[0033] 所述400-500bp的DNA片段可为432bp的DNA片段。
[0034] 所述432bp的DNA片段具体可为序列表中序列3所示的DNA片段。
[0035] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度具体可为55 °C。
[0036] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为95°C5min; 95。〇3〇8,551€3〇8,25个循环；72。(：1〇11^11。
[0037] 所述中药材可为光慈菇和/或毛慈菇和/或冰球子和/或金果榄。
[0038] 所述中药材的基源植物可为老鸦瓣（Amanaedulis)、杜鹊兰（Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、独蒜兰（Pleionebulbocodioides)或云南独蒜兰 (Pleioneyunnanensis)〇
[0039] 利用本发明提供的鉴定光慈菇的方法及其专用引物对能够快捷而简便的鉴定光 慈菇，以保障光慈菇临床用药的安全，具有重大的推广前景和应用价值。
【附图说明】
[0040] 图1为光慈菇及混淆品的系统发育树。
[0041 ] 图2为通用引物对PCR扩增凝胶电泳图。
[0042] 图3为特异性PCR引物对的特异性检测。
[0043] 图4为特异性PCR引物对的灵敏度检测。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0045] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0048] 本实施例中的光慈燕（基源植物为老鸦瓣（Amanaedulis))购自安徽全椒县，毛 慈燕（基源植物为杜鹊兰（Cremastraappendiculata(D.Don)Makino))、冰球子（基源植物 为独蒜兰（Pleionebulbocodioides)或云南独蒜兰（Pleioneyunnanensis))和金果榄均 购自于安徽亳州药材市场。各中药材均符合中国药典（2010年版）一部正文各药材项下的 有关规定，通过鉴定，各位中药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0049] 实施例1、制备用于鉴定光慈菇的试剂盒及其使用方法
[0050] -、用于鉴定光慈菇的引物对的设计与合成
[0051] 从GenBank查找光慈菇（基源植物为老鸦瓣（Amanaedulis))及混淆品的ITS序 列，详见表1。
[0052] 表1.光慈菇及混淆品的ITS序列数量及GenBank登录号
[0053]
[0054]分别用贝叶斯法（Bayesianinference,BI)和简约法（maximumparsimony,MP) 进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树（以水寥（Polygonumhydropiper)的2条 ITS序列（GenBank登录号为JF977851和JF977850)为外群，内群则包括表1中所示的 光慈菇及混淆品的ITS序列）。其中BI树用MrBayesversion3. 1. 2软件构建，MP树用 PAUP*version4.Obeta10 软件构建。构建BI树时，用MrModeltestversion2. 3 软件根 据AIC(AkaikeInformationCriterion)检验标准选择数据的最适模型，所选最适模型是 (GTR+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC)设置为四条链 并运行1000000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽取一个样本， 共形成20002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样，总共剩余的 样本数为19602,用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设置自举重复 次数bootstrapnreps为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发式搜索设置 为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。
[0055] 通过BI法和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树完全一致（图 1)。图1中各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率（posteriorprobability，PP)值和 MP树的自举支持度（Bootstrap，BS)。结果表明，光慈菇所有序列的单倍型形成单系（PP= 1. 00,BS= 90)。
[0056] 在确定光慈菇为单系群的前提下，用软件Clustal X 1.81对所有ITS序列进行对 位排序和比较，找到差异片段，根据光慈菇特有的变异位点设计并合成用于光慈菇鉴定的 大量PCR引物对。
[0057] 对获得的大量PCR引物对依次进行筛选、效果验证、特异性验证和灵敏度验证，最 终获得一对特异性、灵敏度最佳的引物对如下：
[0058] 引物LYB-CP20s:5' -GAGAAGTCGTAACAAGGITTCCGTAG-3'（序列表中序列 1);
[0059] 引物LYB-CP20a:5' -AGGCAGGCGTGCCCGCA-3'（序列表中序列 2)。
[0060] 引物LYB-CP20s和引物LYB-CP20a均为单链DNA分子。
[0061] 理论PCR扩增产物的长度为432bp。
[0062] 二、制备用于鉴定光慈菇的试剂盒
[0063] 用于鉴定光慈菇的试剂盒为将步骤一合成的引物LYB-CP20S和引物LYB_CP20a分 别单独包装后，与分别单独包装的10XPCRBuffer、TaqDNApolymerase、MgCl2(25mM)和 dNTPs等包装于同一个试剂盒中。
[0064] 三、鉴定待测样品中是否含有光慈菇的方法的建立
[0065] 采用步骤二的试剂盒鉴定待测样品中是否含有光慈菇，步骤如下：
[0066] 1、PCR扩增
[0067] 提取待测样品的基因组DNA并以其作为模板，采用步骤二的试剂盒进行PCR扩增 反应，获得PCR扩增产物。
[0068] 反应体系：待测样品的基因组DNA(6 - 50)ng、10XPCRB