一种流感病毒实时检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及流感病毒检测技术领域，具体涉及一种流感病毒实时检测试剂盒及方 法。
【背景技术】
[0002] 流感是一种对公众健康存在持续性和严重性威胁的疾病。随着医疗科学的发展， 目前已有数种药物用于治疗或预防甲型和乙型流感。然而，有效预防控制或治疗流感的前 提在于能够在个体感染或大规模爆发的早期即实现对流感病毒的迅速、敏感和特异性检 测 。
[0003] 流感病毒检测的传统方法通常首先需要对鼻腔冲洗剂、咽喉拭子样本、气道穿刺 吸引分泌物、支气管灌洗液或肺部组织进行培养，在培养后第2-5天时通过血细胞吸附试 验对培养病毒进行检测，并且一般情况下之后均会采用型特异性抗体进行免疫荧光试验 (IFA)以继续检测。床边检测需要的是能够在短时间（例如，少于30分钟）内即得出检测 结果的测试方法，尽管上述检测具有可靠性，但并不适于作为床边检测的方法。
[0004] 因此，人们开发出了效率更高的流感病毒检测方式以满足床边快速检测的需要。 这类检测可分为两种类型。一种是采用特异性抗体对流感蛋白质或抗原进行的检测，另一 种是对甲型与乙型流感病毒中存在的神经氨酸酶的活性进行的检测。尽管此类检测通常可 以在短时间内完成，但其临床灵敏性仍然不足，仅大致相当于传统病毒培养法的70%。上 述快速检测法临床灵敏性的不足是由于分析灵敏度（或检测极限）偏低所导致，因为其检 测限的范围通常仅为1〇 4和10 5CEID50 (鸡胚半数感染量）或TCID50 (半数组织培养物感染 量）流感病毒单位。灵敏度的不足严重地削弱了上述检测法的临床应用。
[0005] 近来，有些论文中公开了一些采用PCR检测流感病毒核酸且具有更高的灵敏度的 检测法。尽管这些方法有着更高的灵敏度，但其普遍具有的一些缺点却使其也难于适应床 边快速检测。例如，这些方法通常都要求进行复杂且耗时较长的制作过程，不仅会增加成 本，而且也增加了检测过程的用时。另外，这些方法（尤其是所谓的实时PCR检测法）还要 求使用价格昂贵的仪器，并要求操作人员受过良好的相关训练，而这些对于大部分床边检 测机构，尤其是医师办公室而目是无法负担的。
[0006] 此外，流感病毒有着极强的抗原变异性，尤其甲型流感病毒是变异最为频繁的一 个类型，每隔十几年就会发生一个抗原性大变异，产生一个新的毒株，这种变化称作抗原转 变亦称抗原的质变；在甲型流感亚型内还会发生抗原的小变异，其表现形式主要是抗原氨 基酸序列的点突变，称作抗原漂移亦称抗原的量变。流感病毒的高变异性增大了人们检测 流行性感冒的难度，人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，也极大地限制现有的针对病 毒核酸或特异性抗体对流感蛋白质或抗原进行检测的试剂应用。
[0007] 为了制备出对流感病毒检测具有更高敏感度的试剂，人们合成了一种可用于化学 发光流感病毒神经氨酸酶检测的底物（《分析生物化学》，2000年；280:291-300)。这种底 物是N-乙酰神经氨酸与spiroadamantyl-l，2-金刚烧（下文中简称金刚烧）通过唾液酸 的2位而形成的一种共辄结构。神经氨酸酶能够使这种共辄键发生裂解，从而释放出在碱 性条件下能够发生氧化反应以产生化学荧光的金刚烷。因此，这种底物可用于对神经氨酸 酶（包括流感病毒神经氨酸酶）的活性进行检测，从而成为一种病原体（如流感病毒）检 测手段。
[0008] 杨威（乙酰神经氨酸衍生物的合成及其在快速检测流感病毒中的应用）公开了一 种流感病毒神经氨酸酶检测的底物及检测方法。所述的检测的底物为：荧光素-N-乙酰神 经氨酸和荧光素-4, 7-二甲基-N-乙酰神经氨酸。采用的检测方法为：首先通过神经氨酸 酶反应释放底物中的荧光素，然后荧光素在荧光素酶的催化下进行化学发光反应，通过检 测荧光素的发光信号来检测流感病毒神经氨酸酶。因为神经氨酸酶反应所需的pH值（流 感病毒为pH6. 5,细菌为pH5.0)与化学发光反应中荧光素酶所需的pH值（pH8.0)之间 有着显著差别，所以上述方法中神经氨酸酶反应和化学发光反应必须分别进行，而这增加 了这种检测的复杂性和成本，降低时效性。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于，为了解决现有技术中检测流感病毒的神经氨酸酶中的两步反 应步骤相对繁琐、耗时、不满足及时性的问题，提供一种流感病毒的神经酰胺酶活性一步反 应、实时检测的试剂盒，用于快速、实时检测流感病毒。
[0010] 同时本发明的目的还在于，提供一种流感病毒的神经酰胺酶活性一步反应、实时 检测的检测方法。
[0011] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0012] 一种流感病毒实时检测试剂盒，包括检测组合物，所述检测组合物pH值为 7. 0-7. 2,组成包括以下：
[0013] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 0·l_80mM;
[0014] BSA0.l-10mg/mL；
[0015] ATP-钠盐 0·l_20mM;
[0016] DTT0.l-40mM；
[0017] 辅酶A0.1-20mM;
[0018] MgS04 0.l-40mM；
[0019] CaCl2 0.l-20mM；
[0020] 甘露醇 3-9% ;
[0021] 蔗糖 2-8% ;
[0022] N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物或其盐2-200μg/mL;
[0023] 萤火虫荧光素酶10-1000μg/ml;
[0024] 所述N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物结构式如式⑴所示，
[0025]
[0026] 其中，RpR2、R3各自为氢或1-5个碳原子的烷基。
[0027] 上述流感病毒实时检测试剂盒，优选的，所述检测组合物，组成包括以下：
[0028] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 60mM;
[0029] BSA4mg/mL；
[0030] ATP-钠盐 18mM;
[0031] DTT16mM；
[0032] 辅酶A8mM;
[0033] MgS04 35mM；
[0034] CaCl2lOmM；
[0035] 甘露醇6% ;
[0036] 蔗糖 4% ;
[0037] N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物或其盐24μg/mL;
[0038] 萤火虫荧光素酶7-9μg/ml。
[0039] 上述流感病毒实时检测试剂盒，还包括捕获剂，所述捕获剂为：浓度为4_6mg/mL 的待检测流感病毒的特异性抗体溶液，所述溶液为〇.lwt%的叠氮化钠溶液，所述待检测流 感病毒的特异性抗体附着于磁粉上。
[0040] 上述流感病毒实时检测试剂盒，还包括流感病毒的裂解缓冲液与清洗缓冲液；所 述清洗缓冲液为0. 005MPBS缓冲液；所述裂解缓冲液为pH7. 0、16mM的Trizma碱，含有 0. 5%的曲拉通X-100。
[0041] 一种流感病毒实时检测试方法，包括：将流感病毒与检测组合物在pH值为 7. 0-7. 2的环境下结合，然后检测是否有萤火虫荧光素信号；所述检测组合物包括萤火虫 荧光素酶和N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物或其盐；
[0042] 所述N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物如式⑴所述，其中，&、R2、R3各自 为氢或1-5个碳原子的烷基。
[0043] 上述流感病毒实时检测试方法，所述检测组合物的组成包括：
[0044] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 0·l_80mM;
[0045] BSA0. 1-lOmg/mL；
[0046] ATP-钠盐 0·l_20mM;
[0047] DTT0.l-40mM；
[0048] 辅酶A0·l_20mM ;
[0049] MgS04 0.l-40mM ；
[0050] CaCl2 0·l_20mM ;
[0051] 甘露醇 3-9% ;
[0052] 蔗糖 2-8% ;
[0053] N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物或其盐2-200μg/mL;
[0054] 萤火虫焚光素酶10-1000μg/ml。
[0055] 上述流感病毒实时检测试方法，所述检测组合物，组成包括以下：
[0056] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 60mM;
[0057] BSA4mg/mL；
[0058] ATP-钠盐 18mM;
[0059] DTT16mM；
[0060] 辅酶A8mM;
[0061] MgS04 35mM；
[0062] CaCl2lOmM；
[0063] 甘露醇6% ;
[0064] 蔗糖 4% ;
[0065] N-乙酰神经氨酸-萤火虫荧光素辄合物或其盐24μg/mL;
[0066] 萤火虫焚光素酶7-9μg/ml。
[0067] 上述流感病毒实时检测试方法，检测组合物使用前于2_8°C下静置2-8小时。
[0068] 上述流感病毒实时检测试方法，还包括：将流感病毒用捕获剂捕获，然后与检测组 合物结合，所述捕获剂为：浓度为4-6mg/mL的待检测流感病毒的特异性抗体溶液，所述溶 液为0.lwt%的叠氮化钠溶液，所述待检测流感病毒的特异性抗体附着于磁粉上。
[0069] 上述流感病毒实时检测试方法，还包