一种同时检测10种虫媒病病原的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及液相芯片检测技术领域，特别是涉及用液相芯片的方法同时检测10 种虫媒病病原的方法和检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 虫媒病是指以吸血的节肢动物作为媒介通过叮咬感染造成人和人、人和动物间传 播的一种疾病。动物临床表现为突然发热、感觉酸疼无力、大面积皮疹、继发性感染造成死 亡等。该病过去曾使成千上万的人畜感染甚至死亡，给经济和人类社会发展带来了一定的 负面影响。20世纪中叶后，随着全球往来加强，也促进了国际动物贸易不断发展，特别是现 代化交通工具的使用缩短了世界各地的距离，这些因素为虫媒病的远距离传播和在全球范 围内扩大流行的趋势提供了更广泛的可能性。目前，随着国际交往的日益频繁，蚊、蜱、蠓等 媒介传入我国边境口岸的风险非常大，虫媒性动物疫病的爆发也有可能随生物虫媒传入我 国。
[0003] 现已知道有100多种虫媒病毒可使动物和人类产生疫病，甚至导致死亡。最有 代表性的包括：蚊媒病：水泡性口炎（Vesicularstomatitis，VS)、西尼罗热（WestNile， WN)、裂谷热（RiftValleyFever，RVF);蜱媒病：非洲猪痕（Africanswinefever,ASF)、 莱姆病（Lymedisease，病原为伯氏疏螺旋体，简称BB)、Q热（QFever，病原为贝氏柯克 斯体，也叫立克次体）；蠓媒病：蓝舌病（Bluetongue，BT)和鹿流行性出血病（Epizootic hemorrhagicdiseaseofdeer，EHD)，施马伦贝格病（Schmallenberg，SB)。这些动物疫病 近年来在周边国家的暴发流行已对我国形成威胁，尤其在2014年2月开始爆发于西非的埃 博拉出血热（EBola)疫情，造成大量的人员发热出血，严重的甚至死亡。因此，提供虫媒性 动物疫病病原检测方法，尤其是能够同时检测多种虫媒病病原的方法具有重要意义。然而 现有技术还没有针对上述10种虫媒病病原实现同时检测，为保障我国农业、卫生、社会安 全绿色发展，有必要研发一种同时检测上述虫媒病病原的快速、特异、高效灵敏的方法。
[0004] 液相芯片称为微球体悬浮芯片（suspensionarray，liquidchip)，是基于 xMAP(flexibleMultiAnalyteProfiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同焚 光编码的微球上进行抗原抗体、酶、底物、配体、受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、 绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完 成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测 技术平台。
[0005] 液相芯片技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断 技术平台，这个技术平台整合了生物检测，乳胶微球荧光编码，微液体传送系统，激光实时 记录，先进电脑软件和数据处理模式等多种先进技术。液相芯片的核心技术是把微小的乳 胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的 特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）。应用时，把针对不同检测物的乳胶微球混合 后再加入微量待检测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经 激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测 速度极快，所以又有"液相芯片"之称。
[0006] 液相芯片技术平台具有高效性：因为上百种颜色的乳胶微球可以在同一个反应体 系内，所以一小份标本（血，或其它体液，组织）可以被用来同时检测上百个生理或病理指 标。液相芯片技术平台具有高敏感性：每个乳胶微球上都可以满满地（以共价键牢固结合 的方式）包被上抗原、抗体、或核酸。因为探针密度高，产生的信号强，加上使用荧光检测， 所以敏感性大大高于任何现有分析、诊断方法，也高于其它芯片法。液相芯片技术平台是一 种快速检测方法：因为杂交在悬浮的液相中进行，所以反应需要时间短杂交后常不用清洗 就可以直接读数，且检测效率大大高于固相杂交，所用时间从几小时缩短到十几分钟。现有 技术中，有采用液相芯片方法检测虫媒病原的方法，参见中国专利CN102181532A，但该方法 针对的9种虫媒病原仅仅为我国境内常见的虫媒病原，并未完全涉及境外流行的虫媒病， 然而在国门口岸检验检疫，仍然需要针对来自虫媒病高发国家的动物或昆虫进行病原检 疫，以提高我国防范虫媒性外来动物疫病远距离扩散的综合防控能力，保障国内动物不受 境外虫媒病原感染。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种同时检测10种虫媒病病原的液相芯片方法；本发明 的目的还在于提供一种同时检测10种虫媒病病原的试剂盒及其应用。
[0008] 为实现上述目的，通过查阅0ΙΕ、国标、行标和相关文献，确定每种虫媒病的特异 性片段，登录GenBank，下载每种虫媒病对应的片段，S卩WNV-E基因、VSV-N基因、ASFV-P72 基因、BTV-NS1 基因、Borreliaburgdorferi-OSPA基因、EHDV-NS3 基因、Coxiella burnetii-ISlllla基因（登录号：M80806)、SBV-S基因（登录号：HE649914)、EBV-NP基因 (登录号：KC545392. 1)、RVFV-NSs基因（登录号：DQ380154)。利用DNAMAN、MEGA、BioEdit、 DNAStar、PrimerPremier5. 0等软件选取其中保守区域、设计、分析并筛选10对特异性引 物、10条特异性探针以及10条验证探针（reversecomplementofprobe，RC-Probe)，捕 获探针5'端进行氨基修饰的C12手臂的标记，下游引物和验证探针5'端进行生物素修饰。 由此，本发明提供了一种用液相芯片同时检测10种虫媒病病原的特异性引物对组合，含有 以下引物对：
[0009] 用于检测非洲猪瘟病毒的上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDN0.1-2所示；
[0010] 用于检测蓝舌病病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 3-4所示；
[0011] 用于检测伯氏疏螺旋体上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 5-6所示；
[0012] 用于检测鹿流行性出血热病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 7-8所 示；
[0013] 用于检测水泡性口炎病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 9-10所示；
[0014] 用于检测西尼罗热病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 11-12所示；
[0015] 用于检测贝氏柯克斯体上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 13-14所示；
[0016] 用于检测裂谷热病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 15-16所示；
[0017] 用于检测埃博拉病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 17-18所示；
[0018] 用于检测施马伦贝格病毒上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 19-20所示。
[0019] 上述下游引物的5'端用生物素标记。
[0020] 进一步地，本发明提供一种与上述的特异性引物对组合配合使用的特异性探针组 合，其含有以下探针：
[0021] 用于检测非洲猪瘟病毒的探针核苷酸序列如SEQIDN0. 21所示；
[0022] 用于检测蓝舌病病毒的探针其核苷酸序列如SEQIDNO. 22所示；
[0023] 用于检测伯氏疏螺旋体的探针核苷酸序列如SEQIDNO. 23所示；
[0024] 用于检测鹿流行性出血热病毒的探针其核苷酸序列如SEQIDNO. 24所示；
[0025] 用于检测水泡性口炎病毒的探针核苷酸序列SEQIDNO. 25所示；
[0026] 用于检测西尼罗热病毒的探针核苷酸序列如SEQIDNO. 26所示；
[0027] 用于检测贝氏柯克斯体的探针核苷酸序列SEQIDNO. 27所示；
[0028] 用于检测裂谷热病毒的探针其核苷酸序列如SEQIDNO. 28所示；
[0029] 用于检测埃博拉病毒的探针其核苷酸序列如SEQIDNO. 29所示；
[0030] 用于检测施马伦贝格病毒的探针核苷酸序列SEQIDNO. 30所示。
[0031] 上述探针在其5'端进行氨基修饰的C12手臂的标记。
[0032] 本发明提供一种液相芯片，含有上述10条特异性探针组合中的10种探针分别与 荧光标记微球偶联制成的10种特异性检测微球。
[0033] 本发明提供了上述10对特异性引物对和10条特异性探针在制备同时检测10种 虫媒病病原的试剂盒中的用途。