一种用于检测PRRSV缺失变异株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测猪繁殖与呼吸综合征病毒技术领域，具体说是一种用于检测猪繁 殖与呼吸综合征缺失变异株病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还包括该试 剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母 猪，该病严重影响其生殖功能。研究人员从流行毒株缺失变异和猪繁殖与呼吸综合征发生 时间顺序以及出现频率推测，所有高致病性猪蓝耳病均来源于CH-la。流行病学资料也表明 所有HP-PRRSV中国分离毒株均具有相同的来源。高志强等和王旭荣等进行流行病学分析 时发现，Nsp2序列各毒株间差异也不尽相同，HB-2(sh)/2002与VR-2332、BJ-4、CH-la同源 性为78. 3%~88. 9% ;Jiangxi-3与BJ-4、CH-la、HB-lJXAl、Henan-l同源性分别为77%、 88%、94. 7%、98. 5%、98.4%。田克恭等总结了区别于传统毒株的高致病性流行毒株的特 点为：Nsp2基因第481位缺失"L"氨基酸，533~561位连续缺失29个氨基酸。基于上述 原因，有必要建立针对缺失变异毒株的病原检测方法。本发明针对缺失变异毒株基因特点 设计、建立了Taqman Real-time RT-PCR(探针法实时定量反转录-聚合酶链反应）检测方 法，优化并组装成试剂盒。
[0003] 目前，国内外就PRRSV的检测方法而言，已有复合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方 法，荧光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能检测是否PRRSV感染，无法区 分哪种毒株感染引起，国内也没有针对缺失变异株的检测方法，国外检测试剂检测一份样 品的价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高使业主无法接受。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服目前生产实践中没有针对缺失变异株PRRSV的 检测方法的不足，提供一种用于能够快速、敏感、准确以及低成本地检测猪繁殖与呼吸综合 征病毒缺失变异株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒。本发明还提供该试剂盒的使用方 法，本试剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪繁殖与呼吸综合征缺失变异株病毒。
[0005] 为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
[0006] -种用于检测猪繁殖与呼吸综合征缺失变异株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 试剂盒，所述试剂盒包含OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列 SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探针引物的混合物。
[0007] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:2引物混合物的包括：
[0008] SEQIDN0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0009] SEQIDN0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0010] 探针引物序列为：
[0011] SEQIDN0:3：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0012] 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。
[0013] SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列：
[0014] SEQIDN0:4(286bp)：
[0016] 所述阴性对照为无RNA酶水。
[0017] 所述阳性对照为含有PRRSV缺失变异株基因序列的阳性质粒pGM-286,其构建方 式如下：
[0018]a.PRRSV缺失变异株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操 作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。以SEQIDNO: 1及SEQIDNO: 2作为 引物扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 个循环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0019] b.PCR产物的克隆及序列分析
[0020] PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定 正确的质粒命名PGM-286,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为358ng/ ul，计算出其拷贝数为1. 13xlOn(copies/ul)，本发明的试剂盒利用1. 13xl07(copies/ul) 浓度的质粒作为阳性对照以及10倍梯度比稀释后作为标准曲线。
[0021] 本发明还提供了所述试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征缺失变异株病毒的使 用方法，包括以下步骤：
[0022] 实时荧光定量RT-PCR，反应体系如下：
[0023]a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；
[0024]b.弓丨物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液3份，其中286bp上游引物1份， 286bp下游引物1份，探针引物1份；
[0025] c.酶混合物1份；
[0026]d.无RNA/DNA酶水 5. 5 份；
[0027]e.提取样品的RNA模板3份；
[0028]f.阳性对照pGM-286阳性质粒3份；
[0029]g.阴性对照无DNA酶水3份。
[0030] 实时荧光定量RT-PCR，扩增条件如下：
[0031] 42°(：反转录5!1^11;94°(：预变性21^11;94 1€2〇8，退火温度541€3〇8,721€2〇8,40个 循环。
[0032] 根据扩增结果，判定标准为：
[0033] 在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可以依扩增得到的Ct值 根据标准曲线对样品进行准确定量。
[0034] 本发明弥补了PRRSV缺失变异株检测上的薄弱环节，与普通RT-PCR方法相比，本 发明省时、省力，成本较低，并且比普通PCR的灵敏度高，对模板浓度要求较低，可用于检测 低微含量的蓝耳病病毒；无需电泳就可直观的反应检测结果，避免了溴化乙锭对人体健康 的危害；本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间 由原来的4-5小时缩短到现在的1-2小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了探针 法，只有探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，因此具有高度特 异，敏感和简单等特点。使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于PRRSV 缺失变异株的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。所述荧光定量方法可 以看到整个扩增过程、扩增效率、溶解温度，利用已知起始拷贝数的标准品直接得到标准曲 线，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，对样品中 病毒含量进行精确定量。本发明试剂盒及其使用方法适用于任何实验室和基层各级防控单 位、兽医站及大中小型养殖场等，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明制作的标准曲线。
[0036] 图2为本发明样本检测图。
[0037]图1中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
[0039] 实施例1
[0040]1、引物的设计和制备
[0041] 参照GenBank(基因库）查找PRRSV变异株毒株十株，经序列比对寻找变异株特定 区域中的保守区段，选取该片段并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
[0042] 扩增引物序列为：
[0043]SEQ ID N0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0044] SEQ ID N0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0045] 探针引物序列为：
[0046] SEQ ID NO:3 ：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0047] 上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
[0048] 阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并 保存。
[0049]2、制作阳性对照及其对应标准曲线
[0050] 阳性对照为含有PRRSV缺失变异株基因序列的阳性质粒pGM-286,其构建方式如 下：
[0051] a. PRRSV缺失变异株基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit说明书进行操 作。以提取的病毒RNA为模板进行反转录合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为 引物扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 个循环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0052] b. PCR产物的克隆及序列分析
[0053]PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定 正确的质粒命名PGM-286,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为358ng/ ul，并计算出拷贝数为1. 13X10n(C〇pies/Ul)，将其10倍倍比稀释后按照标准曲线制作程 序制作标准曲线，依标准曲线将1. 13xl07(copies/ul)浓度的质粒作为阳性对照。
[0054] 3、制备用于检测10头份的试剂盒
[0055] 本试剂盒由以下组分组成：
[0056]a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1；
[0057] b.引物浓度均为lOpmol/ μ 1的三条引物混合液30 μ 1，其中286bp上游引物 10yl，286bp下游引物10μ1，探针引物10μ1 ;
[0058]c.酶混合物10 μ 1 ;
[0059]d.无RNA/DNA酶水100 μ 1 ;
[0060]e.阳性对照pGM-286阳性质粒30 μ 1。
[0061] 4、用本发明试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征缺失变异株病毒
[0062](1) PCR总体系为25 μ 1。分别将本发明试剂盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三条引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、无RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取样品的RNA模板 3 μ 1、阳性对照pGM-286阳性质粒3 μ 1、阴性对照无DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml扩增管中。
[0063] (2)分别向上述扩增管中加入阳性对照3μ1、从具有高热症状的流行猪