一种鲤疱疹病毒ii型实时荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明是一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，具体涉及能实时、快速实 现鲤疱疹病毒II型荧光PCE定量检测的方法，属于水产养殖动物病原检测领域。
【背景技术】
[0002] 鲤疱疹病毒II型（Cyprinidherpesvirus2,CyHV-2)感染引起的鲫鱼疱疹病毒 病是目前发现的唯一感染异育银鲫的病毒性疾病，其死亡率极高，危害巨大，传染性强，可 通过水平和垂直传播，生产实践表明，目前该病尚无有效的预防和控制措施，给养殖户带来 了巨大经济损失，因此该病已成为我国鲫鱼养殖的主要威胁。
[0003] 电子显微镜观察和分子生物学诊断方法是目前对于CyHV-2病毒的主要检测方 法。由于缺少适合培养CyHV-2的细胞系，因此CyHV-2诊断大多数依靠对发病鱼组织进行 组织学检查后再经电子显微镜观察到疱疹病毒粒子进行确证。PCR法由于其可以检测到 组织中极微量的病毒DNA，是目前较为精确检测CyHV-2感染的分子生物学方法，但需经过 凝胶电泳才能观察结果，操作繁琐、极容易交叉污染，且只能定性检测。实时荧光定量PCR (uorescent quantitative real-time PCR，qPCR)是在PCR反应体系中加入焚光结合染料 (如SYBR? green I)或特异性探针(如TaqMan?Probes)，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过Ct (Cq)值和标准曲线对起始模板进行定量分析。由于qPCR灵敏度和 准确性高、重复性好、成本低、操作便捷，被广泛应用于病毒感染和肿瘤癌基因等的定量分 析中。例如：《锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用》（吉林农业 大学学报，2012, 34 (3) :339-342, 354)和《锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 及应用》（中国海洋大学，2007年9月，第37卷第5期)。
[0004] 《锦鲤疱疹病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用》公开了一种有 效的检测锦鲤疱疹病毒病（KHV)检疫方法，需要根据KHV聚合酶基因（Sph)的保守序列设计 1对引物和相应的TaqMan探针，然后建立荧光PCR方法对KHV进行快速检测，能检出的最低 拷贝数为116@102/LL，所建立的荧光PCR检测方法在4h内可报告检测结果，适用于KHV的 快速检疫。
[0005] 《锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用》通过选取KHV病毒TK 基因的保守序列，利用PRMEREXPRESS2. 0设计引物和探针，其中Taqman探针的5z端标记 FAM，3z端标记TAMRA，然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应，检测得 到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数。
【发明内容】
[0006] 为克服现有电子显微镜观察和分子生物学诊断方法用于鲤疱疹病毒II型检测时 存在的操作繁琐、完成度差等缺陷，本发明提供了一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测 方法，所选取的上游引物F、下游引物R和探针P根据鲤疱疹病毒II型特有的保守基因序列 而设计，特异性的识别CyHV-2病毒，特异性强，灵敏度高，可实现CyHV-2病毒的实时监测， 完成度高。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现：一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，包 括提取病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F:5~ CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG-3 ' 下游引物R:5z-CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3 ' 探针P: 5zFAM-TTGTACCAGCACTCGCCAATGAGCA-BHQ3z。
[0008] 经扩增后的基因片段为： CAAAACGGGCTGGCAGTCTCCCATGCTCATTGGCGAGTGCTGGTACAAGTGGAGGGCCTGCAACATGGACAGA CAGTACCCAG〇
[0009] 鲤科疱疹病毒不同型病毒之间基因序列同源性较高，容易产生非特异性扩增， 本方法选择鲤科疱疹病毒II型特有的保守序列，根据CyHV-2 0RF6基因序列（登录号： JQ815364. 1)用软件（PrimerExpress3.0)设计并合成基因特异性引物及Taqman探针，表 现出了较好的特异性。
[0010] 用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取所述病毒样品中CyHV-2病毒的DNA，并置 于-80~-20°C的温度下保存备用。
[0011] 在所述实时荧光PCR扩增检测中，扩增片段为83bp，扩增体系为20~50μL，进一 步的，扩增体系为20~25μL。
[0012] 在上述过程中，选择这一扩增片段和扩增体系的目的是：引物采用Primer Express3. 0软件进行设计，该对引物探针软件评分最高，理论扩增效率最高；该扩增片段 为鲤科疱疹病毒II型特有的保守基因序列，且在0RF6和0RF24中均含有一个拷贝，理论上 比仅有一个拷贝的基因敏感性高50%，扩增体系选择20~50μL体系，可适用于不同的荧光 定量仪检测，适用范围广。
[0013] 所述实时荧光PCR的扩增反应条件包括：94~95°C1~3min，95°C5~15s、 56~58°C30~40s、72°C20~30s，循环35~45次，检测设立阳性对照和阴性对照， 所述阳性对照为阳性质粒标准品。
[0014] 进一步的，可选择：95°C3min;95°C10s、56°C40s、72°C30s，循环 40 次。
[0015] 在实际操作时，取50yLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段并与 PMD19-T克隆载体16°C连接过夜后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞；在含氨苄青霉素的 培养板上37°C培养12h后挑取单个菌落增菌后用小量质粒抽提试剂盒提取质粒，进行PCR 分析鉴定；将筛选的阳性重组质粒进行测序。测序结果在NCBI上进行BLAST分析，序列正 确的阳性质粒即为CyHV-2荧光定量PCR的标准品，即阳性对照。阳性标准品利用implen超 微量分光光度计进行定量读数，计算出拷贝数后进行10倍连续梯度稀释，_20°C保存备用； 阴性对照为ddH20。反应结束后，利用荧光PCR仪器的分析软件，依据Ct值和扩增动力学曲 线进行分析测定。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： (1)本发明是利用实时荧光PCR方法对鲤科疱疹病毒II型进行的快速检测，上游引物F、下游引物R和探针P均根据鲤疱疹病毒II型特有的保守基因序列进行选择，特异性的识 别鲤疱疹病毒II型病毒，特异性强，适用于患病鱼体组织中鲤疱疹病毒II型病毒的快速、 准确测定。
[0017] (2)本发明涉及的上游引物F、下游引物R和探针P选择该病毒具有两个拷贝的基 因序列(在病毒基因组0RF6和0RF24基因各含有一个拷贝的保守序列)进行设计，较现有基 于单拷贝基因设计的引物探针方法，其敏感性可直接提高50%。
[0018] (3)本发明以阳性质粒标准品为阳性对照，构建了以质粒标准品进行的敏感度测 定，该方法能够最低检测到32个拷贝的核酸标准分子，具有灵敏度强、检出限低的优点。
[0019] (4)本发明涉及的检测方法所用试剂简单、微量，设备简单，操作简便、快速，涉及 的试剂可设计为商品化试剂盒，每孔只需25~50μL体系，磁珠法核酸提取过程较快，用时 约为30~40min，焚光定量运行过程约为40~50min，整个操作过程可在2h内完成，满足 口岸、进出口等检验检疫的要求。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明方法中上游引物F、下游引物R和探针P的不同配比终浓度时的扩增 曲线。
[0021 ] 图2为本发明方法中不同退火温度时的扩增曲线。
[0022] 图3为本发明方法中目的片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
[0023] 图4为本发明方法中TaqMan荧光定量PCR检测疱疹病毒2型的标准曲线。
[0024] 图5为本发明方法中敏感性试验对照图。
[0025] 图6为本发明方法中特异性试验对照图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0027] 实施例1: 本实施例涉及一种鲤疱疹病毒II型实时荧光PCR检测方法，该方法包括提取病 毒样品中CyHV-2病毒的DNA，进行实时荧光PCR扩增检测，其中，上游引物F:5z-CTGGGTACTGTCTGTCCATGTTG-3 ' 下游引物R:5z-CAAAACGGGCTGGCAGTCT-3 ' 探针P: 5zFAM-TTGTACCAGCACTCGCCAATGAGCA-BHQ3z。
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