基于纳米孔的通过混合的fret检测的核酸分析的制作方法

文档序号:9528966阅读:598来源:国知局
基于纳米孔的通过混合的fret检测的核酸分析的制作方法
【专利说明】基于纳米孔的通过混合的FRET检测的核酸分析
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年5月24日递交的美国临时专利申请号61/827, 519的优先权 的权益,其内容以其整体被并入本文。
[0003] 背景
[0004] 在过去十年间开发的DNA测序技术已经彻底改革了生物科学,例如Lerner等 人,TheAuk, 127:4-15(2010) ;Metzker,NatureReviewGenetics, 11:31-46(2010);Holt 等人,GenomeResearch, 18:839-846(2008);并且具有彻底改革医疗实践的许多方面的 可能性,例如,Voelkerding等人,ClinicalChemistry, 55:641-658 (2009);Anderson等 人,Genes, 1:38-69 (2010);Freeman等人,GenomeResearch,19:1817-1824(2009);Tucker 等人,Am.J.HumanGenet.,85:142-154(2009)。然而,要实现这种可能性,仍然存在许多 必须解决的挑战,包括减少每次运行测序的成本、简化样品制备、减少运行时间、增加读段 (read)长度、改善数据分析等等,例如,Baker,NatureMethods, 7:495-498 (2010);Kircher 等人,Bioessays, 32:524-536 (2010);Turner等人,AnnualReviewofGenomicsand HumanGenetics, 10:263-284(2009)。利用纳米孔的单分子测序可以解决这些挑战中的一 些,例如,Maitra等人,Electrophoresis, 33:3418-3428 (2012);Venkatesan等人,Nature Nanotechnology, 6:615-624 (2011);然而,这种方法具有其自身的一套技术困难,诸如,可 靠的纳米孔制造、DNA移位率的控制、核苷酸区分、对来自纳米孔传感器的大型阵列的电信 号的检测等等,例如,Branton等人,NatureBiotechnology, 26 (10) : 1146-1153 (2008); Venkatesan等人(以上引用)。
[0005] 核苷酸的光学检测已经作为纳米孔测序领域中的一些技术困难的潜在的解决方 案被提出,例如Huber,国际专利公布W0 2011/040996 ;Russell,美国专利6, 528, 258; Pittaro,美国专利公布2005/0095599Joyce,美国专利公布2006/0019259 ;Chan,美国专 利 6, 355, 420;McNally等人,NanoLett.,10 (6) : 2237-2244 (2010)等等。然而,由于多种 原因,并未实现基于光学的纳米孔测序,所述多种原因包括缺乏合适的制造技术以及缺乏 对此类系统的元件如何相互作用的认识。
[0006] 鉴于上述内容,如果存在允许对分析物诸如核酸的序列的成功的光学感测和分析 的光学元件的可用的材料和配置,这对于通常的纳米孔传感器技术和其特定应用,诸如基 于光学的纳米孔测序将是有利的。
[0007] 概述
[0008] 本文提供了在微流控和/或纳米流控装置中光学检测和分析诸如多核苷酸的聚 合物用于确定核酸的序列的多种方法,所述微流控和/或纳米流控装置诸如使用纳米孔的 那些。
[0009] 在某些变化形式中,一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步骤:(a) 使多核苷酸,例如单链多核苷酸或双链多核苷酸移位穿过纳米孔,以便多核苷酸的核苷酸 顺序经过与纳米孔毗邻放置的FRET对的第一成员,当核苷酸离开纳米孔时多个核苷酸处 于FRET对的第一成员的FRET距离内并且核苷酸的至少一部分被FRET对的第二成员标记; (b)使与纳米孔毗邻的FRET对暴露于光束以便FRET在FRET距离内的FRET对的第一成员 与多个第二成员之间发生以产生混合的FRET信号;(c)当多核苷酸移位穿过纳米孔时测量 混合的FRET信号;以及(d)从混合的FRET信号确定多核苷酸的核苷酸序列。在一些实施 方案中,纳米孔被布置在固相膜中并且FRET对的第一成员附接至固相膜,与所述纳米孔毗 邻。在其他实施方案中,纳米孔是蛋白质纳米孔并且FRET对的第一成员附接至蛋白质纳米 孔。
[0010] 在另一变化形式中,一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步骤:(a) 使多核苷酸,例如单链多核苷酸或双链多核苷酸移位穿过具有出口的纳米孔,以便多核苷 酸的核苷酸在离开纳米孔后顺序通过FRET区域,FRET区域在此通过期间包含多个核苷酸 并且核苷酸的至少一部分被FRET对的至少一个第二成员标记并且FRET对的至少一个第一 成员处于FRET区域内;(b)使FRET区域内的FRET对的第一成员和第二成员暴露于光束以 便FRET在FRET对的第一成员和第二成员之间发生以产生混合的FRET信号;(c)当多核苷 酸移动穿过FRET区域时测量混合的FRET信号;以及(d)从混合的FRET信号确定多核苷酸 的核苷酸序列。
[0011] 在另一变化形式中,一种确定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步骤:(a) 使具有标记的核苷酸的多核苷酸,例如单链多核苷酸或双链多核苷酸移位穿过纳米孔,所 述纳米孔被定制尺寸(dimension)以便核苷酸上的标记物被限制以抑制FRET反应,核苷酸 上的标记物作为FRET对的第二成员,并且以便多核苷酸的核苷酸在离开纳米孔后顺序通 过FRET区域,FRET区域在此通过期间包含多个核苷酸并且FRET对的至少一个第一成员处 于FRET区域内;(b)使FRET区域内的FRET对的第一成员和第二成员暴露于光束以便FRET 在第一成员和第二成员之间发生以产生混合的FRET信号;(c)当多核苷酸移动穿过FRET 区域时测量混合的FRET信号;以及(d)从混合的FRET信号确定多核苷酸的核苷酸序列。
[0012] 在许多实施方式和应用中例证了多种方法、系统和装置,其中的一些被总结如下 并且贯穿本说明书。
[0013] 附图简述
[0014] 图1A示意性地阐明了具有对用单一种类的受体分子标记的多核苷酸分析物进行 的混合的FRET信号采集的一个实施方案。
[0015] 图1B显示了用单一种类的受体分子标记的测试多核苷酸的混合的FRET信号的数 据。
[0016] 图1C示意性地阐明了具有对用两种受体分子标记的多核苷酸分析物进行的混合 的FRET信号采集的另一个实施方案。
[0017] 图1D显示了用两种受体分子标记的测试多核苷酸的混合的FRET信号的数据。
[0018] 图2A至2C阐明了杂合生物传感器的一个实施方案。
[0019] 图2D阐明了通过使用寡核苷酸杂交来放置FRET对的成员的装置的实施方案。
[0020] 图2E阐明了杂合纳米孔的一个实施方案,其中固态膜(201)的表面涂覆了疏水性 层(202),脂质层(203)粘附于疏水性层(202)上。脂质与插入的孔蛋白质形成千兆欧姆封 接(gigaohmseal)〇
[0021] 详述
[0022] 虽然本文描述的多种方法、系统和装置服从于多种修改形式和替代形式,其细节 已经通过举例显示于附图中并且将被详细描述。然而应该理解的是,意图并非限制于所描 述的具体的实施方案。相反,意图覆盖落在本发明的精神和范围内的所有修改形式、等价物 和替代物。例如,为了阐明的目的显示了具体的纳米孔类型和数目、具体的标记物、FRET对、 检测方案和制造方法。然而应该领会的是,本公开内容并非意图被限制在这一方面,因为可 以利用其他类型的纳米孔、纳米孔阵列和其他的制造技术来实施本文所讨论的系统的多个 方面。关于某些方面的指导见于本领域普通技术人员所熟知的许多可得的参考文献和论 述中,包括,例如,Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Impe;rialCollegePress, 2004); Levinson,PrinciplesofLithography,第二版(SPIEPress, 2005);Doering和Nishi,编 辑,HandbookofSemiconductorManufacturingTechnology,第二版(CRCPress, 2007); Sawyer等人,ElectrochemistryforChemists,第2版(WileyInterscience, 1995); Bard和Faulkner,ElectrochemicalMethods:FundamentalsandApplications,第 2版(Wiley, 2000) ;Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,第3版 (Springer, 2006) ;Hermanson,BioconjugateTechniques,第二版(AcademicPress, 2008) 等等,其相关部分通过引用并入本文。
[0023] 本文所描述的多种方法和系统涉及使用纳米孔和FRET对以测量分析物,诸如聚 合物分析物的性质。FRET对通常是一个或更多个FRET供体和一个或更多个FRET受体, 其中每一个供体能够与每一个受体发生FRET反应。在一方面,这意味着,FRET对的供体 具有与受体的吸收光谱基本上重叠的发射光谱。在另一方面,供体和受体的跃迀偶极子 (transitiondipole)必需以允许有效能量转移的方式对齐(aligned)。某些变化形式部 分地基于在以下条件下使用FRET对的识别和鉴别:其中在检测事件期间多个FRET受体产 生FRET信号以便混合的FRET信号被收集。在一些方面,某些变化形式部分地还基于对纳 米孔的FRET抑制性质的发现和鉴别,和应用该性质以使得能够检测移位穿过纳米孔的标 记的分析物。人们认为,尽管本文描述的变化形式并不意图因此被限制,可选择具有定制尺 寸的孔洞(bore)的纳米孔以便FRET对的标记物在移位穿过纳米孔时不能够定向参与FRET 相互作用。基于纳米孔的经限制的直径,纳米孔的孔洞中的多核苷酸的标记物的偶极子在 其转动自由度方面被限制。偶极子对齐与附接至纳米孔的相应的FRET对的对齐的该减少 极大地限制了FRET的效率。标记的多核苷酸可以在离开纳米孔之后参与FRET相互作用, 届时分析物(例如多核苷酸)上的FRET受体或供体恢复转动自由度,这允许混合的FRET 事件。
[0024] 取决于被检测的分析物的类型、所采用的供体和受体的类型、纳米孔、供体和受体 的物理排列、分析物是否被供体或受体标记等等,涵盖了广泛范围的实施方案。在一个实施 方案中,测量的分析物是受体标记的聚合物,特别是受体标记的多核苷酸。在后一实施方案 的一个种类中,多核苷酸分析物的不同核苷酸被一种或更多种不同种类的受体标记,使得 多核苷酸的核苷酸序列可以通过测量当其移位穿过纳米孔时产生的混合的FRET信号来确 定。在另一种实施方案中,测量的分析物是供体标记的聚合物,特别是供体标记的多核苷 酸。多核苷酸的序列可以通过测量当其移位穿过纳米孔时的混合的FRET信号来确定。在 又另一个实施方案中,多核苷酸分析物的四种核苷酸的至少一种被FRET对的成员标记。被 标记的核苷酸在多核苷酸中的位置通过使标记的多核苷酸移位穿过标记的纳米孔并测量 FRET事件来确定。通过标记同一多核苷酸样品的剩余的核苷酸以及随后使所述样品移位 穿过标记的纳米孔,产生多核苷酸的子序列。此类子序列可以被重新排列,产生多核苷酸的 全部序列。图1A中示意性地阐明了以上方面和实施方案的一些。聚合物分析物(1000),诸 如多核苷酸,被例如电泳驱动穿过纳米孔(1002),所述纳米孔(1002)限制聚合物(1000)的 构象以便其单体单元以与其在聚合物中的一级序列相同的顺序移位穿过纳米孔。此外,如 以上提及的,每当受体标记的单体单元处于纳米孔(1002)的孔洞中时,此类受体与其FRET 对中的供体(例如1012)之间的FRET相互作用被抑制。此抑制通常意味着,即使此类受体 处于供体的FRET距离内,由于受体和供体的偶极子的不利的定向,不会产生可检测的FRET 信号。另一方面,一旦受体标记的单体单元从纳米孔的孔洞中脱离进入FRET区域(1008), 强FRET信号立刻产生(由于供体(1012)的接近),之后随着受体和供体之
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