6-乙基鹅去氧胆酸异构体的合成及其分离测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种奥贝胆酸（OCA)异构体的合成，奥贝胆酸及其异构体的分离方 法。具体地设及OCA-aaP体，OCA-aPa体的合成，W及分离测定OCA及OCA-a曰P体，OCA-a0a体的方法。
【背景技术】 阳00引奥贝胆酸（ObeticholicAcid, 0CA)，又名6-乙基碟去氧蛋散，是一种通过活化尼 醇X受体抑制细胞色素7A1促进胆酸分泌因而治疗原发性胆汁硬化和非酒精脂肪性肝病的 新型药物。该要药物活性高于熊去氧胆酸，副作用低，并能有效降低碱性憐酸酶和血清憐酸 酶（碱性憐酸酶是表示肝脏疾病程度的一种生物标记）。
[0003] 奥贝胆酸（I)较熊去氧胆酸有显著的临床优势，近年来处于临床研究阶段，有潜 力作为新一代的非酒精性脂肪肝的药物应用于临床。
[0004]
阳〇化]文献W02013192097、US20130345188A1报道了奥贝胆酸的合成方法，工艺路线如 下：
[0007] 即采用化合物A为原料，经钮碳还原得到化合物B，再经过四氨棚钢还原制备得到 OCA。
[0008] 根据结构可知，该化合物含有多个手性中屯、，尤其是6位乙基，7位径基的手性均 在合成过程中引入。在化合物C制备过程中存在构型转化的步骤，在四氨棚钢进行还原的 过程中，引入7位手性径基。尽管上述反应立体选择性良好，但是由于反应过程复杂，构型 转化不完全等因素，导致奥贝胆酸中潜在奥贝胆酸异构体，尤其是6位，7位异构体，即奥贝 胆酸a0a，奥贝胆酸aa0异构体。尤其是在化合物B的制备过程中，根据文献提高的 方案，即采用氨氧化钢水溶液为溶剂，100 °c反应，并进行转构型，研究发现，构型转化不完 全，潜在的引入了手性杂质。
[0009] 文献W02013192097报道了上述两种异构体在OCA中的控制限度，但是未给出上述 异构体的合成方法W及与奥贝胆酸的色谱分离方法。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了一种OCA异构体OCA-Q 0 a和OCA-Q a 0的制备方法。
[0011] 本发明的目的是提供一种分离测定OCA异构体方法，目的在于检测并分离OCA及 其异构体，从而为OCA质量控制提供方法。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供W下技术方案：
[0013] 一种制备OCA异构体OCA- a 0 a的制备方法，包括步骤；
[0014] 1)化合物A催化加氨还原生成化合物B; 阳01引。化合物B还原得OCA-曰0曰；
[0016] 3) OCA - a 0 a进行柱层析得高纯度OCA-a 0曰
[0017] 所述工艺路线如下：
[0019] 更具体地，步骤1中，所述反应是在溶剂中进行，反应溶剂选自甲醇，乙醇，氨氧化 钢水溶液及其混合物，反应溫度为25~30°C，优选20°C;化合物A与金属钮的重量比为 1:0.Ol~0. 05。
[0020] 研究发现，文献W02013192097采用较高的溫度进行氨化，在反应过程中即生 成化合物B，也生成化合物C，为得到较高纯度的化合物B，W便进行后续反应，本发明在 W02013192097提示下，降低反应溫度，可显著遏制转构进程，在溫度25°C时，反应进行彻 底，且能够得到较高纯度的化合物B。在逐步升高溫度至50~60°C及W上溫度时候，化合 物C的比例显著增加。
[0021]
[0022] 根据上述实验可知，反应控制在25°C即可得到相对高纯度的化合物B，并抑制化 合物C的生成。另外，研究发现在更加低的溫度下，例如反应溫度为15°C时，反应速度极其 缓慢，同时化合物B转构现象比较明显。
[0023] 步骤2中，所述还原反应是在溶剂中还原剂作用下进行。反应溶剂选自0. 5~2% 氨氧化钢水溶液；还原剂选自氯基棚氨化钢，=乙酷基棚氨化钢，棚氨化钢，棚氨化钟，优选 四氨棚钢；反应溫度为30-50°C，优选35°C。该步骤得到的OCA-a0a纯度低于90 %，需 进一步采用纯化步骤进行纯化。
[0024] 文献CN200680017025. 6公开采用四氨棚钢为还原剂，25% (m/v)氨氧化钢水溶液 为溶剂的还原体系，并且制备得到OCA-Q0a(即CN200680017025. 6文献中化合物IB)，文 献未给出具体操作方案。研究表明，在文献条件下，由于采用高浓度氨氧化钢水溶液体系， 反应溫度较高，导致OCA-aea大量转构形成OCA,不利于OCA-aea的富集与制备。在 本发明中，通过摸索不同的试验条件，确定采用采用本发明的技术方案，可得到OCA-Q0a 显著富集的产品。
阳026]从上表可知，随着氨氧化钢碱浓度的降低，OCA-a0a纯度增加，且在0. 5~2%的范围内纯度比较稳定。
[0027] 步骤3中，所述的柱层析填料选自SP20SS，HP20SS，SP207SS，洗脱剂选自甲醇/水， 乙腊/水，丙酬/水，乙醇/水等混合物溶剂，其中有机相与水的体积比为1~3 :10。经过 纯化后的OCA-a0a纯度可达到97%W上，满足作为杂质对照品用于OCA的质量控制。
[0028] 本发明选择了S种反相填料作为分离纯化OCA-Q0a的填料，研究发现，运些填 料在有机溶剂/水混合物体系下能够纯化得到高纯度的化合物OCA-Q0a。
[0030] 采用本发明的纯化技术方案，可W将OCA-aea的纯度由90%不到提高至97% 社。 阳03U -种OCA异构体OCA- a a 0的制备方法，包括步骤；
[0032]a)化合物B经构型转化得到化合物C; 阳03引 b)化合物C经金属钢还原得OCA- a a 0 ;
[0034] c)0CA-a ae进行柱层析得OCA-a ae;
[0035] 所述工艺路线如下：
[0037]更具体地，步骤a)中，化合物B在碱性水水溶液中经热处理，转化得到中间体C，所 述碱性溶液为氨氧化钢水溶液，转构溫度为75~105°C，优选100°C;
[00測步骤b)中，化合物C在金属钢的作用下还原得OCA-aa0，反应溶剂选自2-仲下 醇，叔下醇，反应溫度为50~100°C，优选75°C;化合物B与金属化的质量比为1:2~5， 优选1:3,需加入2%的NiClz催化反应。该步骤得到的OCA-a0a纯度接近90%，需进一 步采用纯化步骤进行纯化。
[0039] 文献CN200680017025. 6公开了采用金属钢还原制备得到异构体的方法，即采用 3 :1至3 :2的比例将化合物C与溶解有金属钢的仲下醇溶解进行反应得到目的物。研究表 明，采用上述反应条件，样品纯度极低，达不到50 %，不利于制备杂质对照品使用。
[0040] 研究发现，显著加大金属钢的用量，并引入相当于化合物C2%质量分数（催化剂 与化合物C的质量比为1:50)的催化剂NiClz,可显著提高OCA-Q 0a纯度。
[0041 ]
[0042] 综上可知，在根据文献采用3:1当量的金属钢，W及不添加催化量NiC12的情况 下，纯度仅约47%，在显著增加金属钢用量，并添加约2 %质量分数的NiC12的情况下，OCA-a0a纯度均可达80%W上，有利于后续的分离纯化。
[00创步骤C)中，所得的OCA-aa0粗品采用柱层析进行纯化，得到OCA-aa0，所述 的色谱柱填料包括SP20SS，HP20SS，SP207SS，洗脱剂选自甲醇/水，乙腊/水，丙酬/水，乙 醇/水等混合物溶剂，有机相与水的体积比为1~3:10,经过纯化后的OCA-Qa0纯度可 达到98%W上，满足作为杂质对照品用于OCA的质量控制。 W44] 本发明选择了S种反相填料作为分离纯化OCA-Q a 0的填料，研究发现，运些填 料在有机溶剂/水混合物体系下能够纯化得到高纯度的化合物OCA-Q a 0。
阳046] 采用本发明的纯化技术方案，可W将OCA-Q0a的纯度由不到90%提高至97% 社。
[0047]本发明的实施方案中，提供了分离OCA及其异构体的色谱，包括采用高效液相 色谱法进行拆分，其中色谱柱选自C18色谱柱，填料为十八烷基硅烷键合硅胶，检测器选 自化SD-2000(蒸发光散射-2000型）检测器，流动相选自乙腊/0. 1%甲酸水溶液，甲醇 /0. 1 %甲酸水溶液；色谱柱溫为25~35°C，优选30°C，流动相流速为0. 5ml/min~1. 5ml/ min,优选I.Oml/min，氮气气流为2.O~2.化/min,漂移管溫度90~110°C。
[0048] 下面结合附图及其实施例，对本发明进一步进行说明，需要理解的是，W下实施例 仅是对本发明的描述，不应将此理解为本发明的保护范围仅限于W下实施例。
【附图说明】 W49] 附图1 :奥贝胆酸a0a体HNMR图谱 [0050] 附图2 :奥贝胆酸a0a体ES-图谱 阳05U 附图3 :奥贝胆酸aa0体HNMR图谱 阳05引附图4 :奥贝胆酸aa0体ES-图谱
[0053] 附图5:奥贝胆酸（RT36. 743min)W及奥贝胆酸aa0体（RT24. 8