一种高特异性苯醚甲环唑多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子化合物免疫分析技术领域，设及一种=挫类杀菌剂的高特异性 多克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 苯酸甲环挫，又名恶酸挫，是一种广谱高效的S挫类内吸性杀菌剂，能够强烈地抑 制致病菌细胞膜重要组成部分一麦角酱醇的生物合成，从而破坏细胞膜的结构与功能，对 作物有持久保护和治疗作用。
[0003] 苯酸甲环挫属于低毒类杀菌剂，对人的每日容许摄入量为O.Olmg/kg体重。通 过对苯酸甲环挫的急性毒性的研究表明，该种药物的大鼠急性经口半数致死量（LD50)为 1453mg/kg，兔子的急性经皮LD50为大于2010mg/kg。对兔子皮肤和眼睛有刺激作用，对豚 鼠无皮肤过敏反应。大鼠急性吸入致死中浓度化巧0) (4小时）为大于0.045mg/L空气，野 鸭急性经口LD50为大于2150mg/kg。（鱼工）縛1X50(96小时）为0. 8mg/L，对蜜蜂无毒。 对于苯酸甲环挫的亚慢性经口毒性的研究资料，目前在我国出现的还比较少，但最近一些 研究表明雌性、雄性大鼠苯酸甲环挫的亚慢性经口毒性的无明显损害作用剂量（NOAEL)均 在低剂量组（300mg/kg)。虽然毒性蓄积性不强，但如果残留量高于残留限量标准，也会对人 体带来严重的伤害。
[0004] 目前常用的苯酸甲环挫检测方法有气相色谱法（GC)、气相色谱-质谱联用法 (GC-M巧和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-M巧，传统仪器方法存在前处理复杂，仪器和 相应配套费用昂贵，无法大规模进行平行样同时检测等缺点。酶联免疫分析法具有方法简 单，方便讯速，特异性强等优点，在苯酸甲环挫残留检测中还没有广泛应用，有良好的发展 前景。
[0005] 在酶联免疫分析法中，半抗原及人工抗原的合成通常是制备抗体的关键步骤，所 W本发明的关进技术是半抗原的结构设计。苯酸甲环挫作为一种小分子物质不具有免疫原 性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原， 并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物产生针对性的特异性抗体。运种半抗原与 大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方 式、载体种类、W及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、 极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此人工抗原 的制备是决定产生其特异性抗体的关键。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在通过人工抗原的制备，建立一种高特异性苯酸甲环挫多克隆抗体的制 备方法，为后续的研究巧实基础，W实现对苯酸甲环挫的定量检测。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案是运样实现的：
[0008] 苯酸甲环挫多克隆抗体的制备包括人工抗原的制备和动物免疫过程，包括如下 步骤：
[0009] I)苯酸甲环挫半抗原的制备：
[0010] 称取6.0~7. 5g怔MIM]C1加入干燥的S口烧瓶中，向其中缓缓加入12. 5~ 13. 5g无水S氯化铁固体，在氮气保护下反应过夜，得到[BMIM]Cl-FeCl3离子液体；在反 应好的离子液体中直接加入8. 5~12.0血3,4'-二氯二苯酸，5. 5~8.0血漠代乙酷 氯，装上冷凝管，在冷凝管顶部装上氯化巧吸水装置，于50~80°C下加热回流反应3~ 6h，反应结束后将反应体系转入到烧杯中，用环己烧提取产物，将提取液于30~60°C 旋干；W石油酸和乙酸乙醋为展开剂将上述产物通过硅胶柱进行分离纯化，得到中间体 2-漠-1-(2-氯-4-(4-氯苯氧基）苯基）乙酬；分别称取8. 5~10.Omg4-氨基下酸，4. 5~ 6.Omg碳酸氨钢，8. 5~12. 5mg舰化钟，放入圆底烧瓶中，加入0. 5~1. 0血水使其溶解，再 加入20. 0~30.Omg中间体2-漠-1-(2-氯-4-(4-氯苯氧基）苯基）乙酬的DMF溶液， 60~90°C加热回流反应3~化；然后加入丙酬共沸，旋蒸除去DMF，混合物用乙酸乙醋和水 多次萃取后，收集有机相并旋干乙酸乙醋，得到淡黄色粘稠液体，即为苯酸甲环挫半抗原；
[0011] 2)苯酸甲环挫半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原： 阳01引 称取10. 0~20.Omg步骤1)制备的半抗原溶于200~500JiLN,N-二甲基甲酯 胺值MF)中，加入6. 1~7.OmgN-径基班巧酷亚胺（N服）和11. 5~12. 9mgN，N-二环已 基碳二亚胺值CC)，室溫揽拌16~24h后，有浑浊物产生，离屯、除去沉淀，取上清液100~ 400化缓慢加入到1~4血溶有15~30mg牛血清白蛋白度SA)的憐酸盐缓冲液中，在室 溫下反应3~化后将反应液移入透析袋中，在4°C下，浸入憐酸盐缓冲液中透析=天，得到 免疫原1，即化Pten-BSA;取上述上清液20~100yL缓慢加入到1~4血溶有15~30mg 钥孔血蓝蛋白化LH)的憐酸盐缓冲液中，在室溫下反应3~化后将反应液移入透析袋中， 在4°C下，浸入憐酸盐缓冲液中透析S天，得到免疫原2,即Hapten-KLH;
[0013] 3)W混合酸酢法制备包被原：
[0014] 称取8.0~10.Omg步骤1)制备的半抗原，溶于200~500yLN，N-二甲基甲酯 胺（DMF)中，4°C预冷，加入4~6JiLS正下胺，反应8~15min后，再加入1~4JiL氯甲 酸异下醋，于冰水浴中揽拌反应0. 5~2.化；称取8. 0~12.Omg鸡卵白蛋白（OVA)溶解于 2~5ml碳酸盐缓冲液中，揽拌下缓慢加入上述反应液，4°C反应过夜后将反应液移入透析 袋中，在4°C下，浸入憐酸盐缓冲液中透析=天，即可得到包被原； 阳01引 4)免疫动物，制得苯酸甲环挫多克隆抗体。
[0016]进一步，步骤1)中，称取6. 99g怔MIM]C1加入干燥的100血S口烧瓶中，向其中 缓缓加入12. 975g无水S氯化铁固体，在氮气保护下反应过夜，得到怔MIM]Cl-FeCls离子 液体；在反应好的离子液体中直接加入IOmL3,4'-二氯二苯酸，7mL漠代乙酷氯，装上冷 凝管，在冷凝管顶部装上氯化巧吸水装置，于60°C下加热回流反应化，反应结束后将反应 体系转入到烧杯中，用环己烧提取产物，将提取液于45°C旋干；W石油酸和乙酸乙醋为展 开剂将上述产物通过硅胶柱进行分离纯化，得到中间体2-漠-1-(2-氯-4-(4-氯苯氧基） 苯基）乙酬；分别称取9. 73mg4-氨基下酸，5mg碳酸氨钢，IOmg舰化钟，放入50mL圆底烧 瓶中，加入800yL水使其溶解，加入22. 62mg中间体2-漠-1- (2-氯-4- (4-氯苯氧基）苯 基）乙酬的4mLDMF溶液，70°C加热回流反应化，然后加入丙酬共沸，旋蒸除去DMF，混合物 用乙酸乙醋和水多次萃取后，收集有机相并旋干乙酸乙醋，得到淡黄色粘稠液体，即为苯酸 甲环挫半抗原。
[0017] 进一步，步骤2)中，称取15mg步骤1)制备的半抗原溶于300 yLN，N-二甲基甲 酷胺值MF)中，加入6.78mgN-径基班巧酷亚胺（N服）和12. 16mgN，N-二环已基碳二亚胺 值CC)，室溫揽拌1化后，有浑浊物产生，500化pm离屯、IOmin除去沉淀，取上清液200 y L缓 慢加入到2mL溶有20mg牛血清白蛋白的憐酸盐缓冲液中，在室溫下反应4h后将反应液移 入透析袋中，在4°C下，浸入憐酸盐缓冲液中透析=天，得到免疫原1，即Hapten-BSA ;取上 述上清液40 y L缓慢加入到2mL溶有20mg钥孔血蓝蛋白的憐酸盐缓冲液中，在室溫下反 应地后将反应液移入透析袋中，在4°C下，浸入憐酸盐缓冲液中透析=天，得到免疫原2,即 Hapten-KLH。
[0018] 进一步，步骤3)中