一株普特拉链霉菌和衍生菌及其它们在防治植物真菌病害中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业微生物技术领域，具体地指一株普特拉链霉菌和衍生菌及其它们 在防治植物真菌病害中的应用。
【背景技术】
[0002] 放线菌可W产生丰富的次生代谢产物，目前发现的近万种天然抗生素中约有=分 之二是放线菌产生的，而链霉菌又是放线菌中产生抗生素最多的一类微生物。一些链霉菌 产生的次生代谢产物对某些植物病原真菌的抱子萌发、菌丝生长和对植物的侵染具有显著 的抑制作用，在植物病害防治中具有重要意义。其中一些链霉菌产生的次生代谢产物已进 行商业化生产，大规模应用于植物病害的防治中。例如由吸水链霉菌井冈变种发酵产生的 井冈霉素已成为我国防治水稻纹枯病最有效的杀菌素。
[0003] 但是，由于多数野生型链霉菌的次生代谢产物产量很低，次生代谢产物的纯化难 度很大。通过诱变的方法（如紫外线诱变、氯化裡加紫外线复合诱变等）对野生型链霉菌 进行诱变改良可W大幅度提高链霉菌次生代谢产物的产量，降低链霉菌次生代谢产物纯化 的难度。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题就是提供一株普特拉链霉菌和衍生菌及其它们在防 治植物真菌病害中的应用。 阳0化]为实现上述目的，本发明提供的一株普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I菌株，其保藏编号为：CCTCCNO:M2015515。普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis) F-I菌株与《链霉菌鉴定手册》和《放线菌的分类和鉴定》中普特拉链霉菌（Streptomyces platensis)运一种群的相关特征描述相似。在此基础上，通过分子水平上的16SrDNA鉴定 方法，PCR扩增得到其16SrDNA序列，将此序列在NCBI上进行BLAST同源比对和系统进化 树分析，发现链霉菌F-I与普特拉链霉的同源性高达99. 93%。因此，将菌株F-I定名为普 特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I。
[0006] 该菌是从湖北武汉地区水稻植株上分离得到，该菌种已于2015年9月8日保藏于 中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC);保藏登记号为CCTCCM2015515 ;保藏地点为：中 国、武汉、武汉大学。
[0007] 进一步地，所述普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-I菌株置于葡萄糖马 铃馨琼脂培养基PDA上培养一周，菌丝发达、气生菌丝丰茂呈粉状，无可溶性色素；菌丝弯 曲较多分枝，无横隔膜，无断裂。抱子丝波曲或螺旋状，抱子呈卵圆形或短杆状，表面光滑， 长1~3ym;该链霉菌F-I使淀粉水解，在纤维素上不生长，明胶液化微弱，牛奶腺化可凝 固，不产生&S。该菌能较好利用葡萄糖、麦芽糖、果糖和肌醇，可利用乳糖、甘油、甘露醇， 不利用薦糖和山梨醇。链霉菌F-I生长溫度范围在10°C~40°C之间，最适宜生长溫度为 28°C~35°C。
[0008] 本发明提供了一株普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株，所述 普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株是由普特拉链霉菌（Str^tomyces platensis)F-l菌株经紫外光线光照突变得到，具体步骤如下：
[0009] 1)将普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-l菌株置于PDA斜面培养基上培 养两周，向试管中加入适量无菌水，刮洗菌落表面的抱子，振荡均匀，即为抱子悬浮液，其中 的抱子浓度为1〇7个抱子/mL;
[0010] 2)将链霉菌F-I抱子悬浮液置于瓦数为30~IOOW的紫外灯下光照5~135s，分 离筛选得到抑菌活性增强的菌株，并将其命名为普特拉链霉菌（Streptomycesplatensis) UV-46。
[0011] 本发明还提供了一株普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10菌株，其保藏 编号为：CCTCCNO:M2014361;所述普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10菌株是 将普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46置于氯化裡水溶液中，并经过紫外光线 光照突变得到；
[0012] 该菌种已于2015年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC);保 藏登记号为CCTCCNO:M2014361 ;保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。 阳〇1引具体步骤如下：
[0014] 1)将普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)UV-46菌株置于PDA斜面培养基上 培养两周，向试管中加入适量无菌水，刮洗菌落表面的抱子，振荡均匀，即为抱子悬浮液，其 中的抱子浓度为1〇7个抱子/mL;
[0015] 2)将链霉菌UV-46抱子悬浮液中添加氯化裡，抱子液中氯化裡的浓度分别 为0.3 %、0. 4 %，室溫下静置4小时后置于瓦数为30~IOOW的紫外灯下光照5~ 135s，分离筛选得到抑菌活性最强的菌株，并将其命名为普特拉链霉菌（Streptomyces platensis)3-10。
[0016] 本发明还提供了一种普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)F-l、普特拉链霉 菌（Streptomycesplatensis)UV-46、普特拉链霉菌（Streptomycesplatensis)3-10 在制 备抗植物真菌病害生防制剂中的应用，其中，所述生防制剂的有效成分含有上述=种普特 拉链霉菌菌体中任意一种菌体在液体培养基中培养得到的液体培养物经过滤形成的滤液。
[0017] 进一步地，所述植物真菌病害为草替灰霉病和油菜菌核病。
[0018] 再进一步地，所述滤液的制备方法，包括W下步骤：
[0019] 1)从上述S种菌种普特拉链霉菌菌体中任意一种菌体接种在PDA斜面培养基上， 在溫度为28°C、光照条件下培养两周，向试管中加入适量无菌水，刮洗菌落表面的抱子，振 荡均匀，得到抱子悬浮液，其中，抱子悬浮液中，抱子浓度为1〇7个抱子/mL;
[0020] 。按体积百分比0. 1~0. 5 %将抱子液接种至PDB培养液中，在溫度28°C、20化/ min的条件下振荡培养3d;得到培养物；
[0021] 3)将培养物离屯、，取离屯、上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次 过滤，得到滤液。
[0022] 其中，PDB液体培养基的配方：马铃馨200g，葡萄糖20g，补充蒸馈水至1000ml。
[0023] PDB制作方法：将洗净后去皮的马铃馨切片，加水1000 ml煮沸约半小时，用纱布滤 去马铃馨，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，揽拌溶解后分装灭菌。
[0024] 本发明的有益效果在于： |；0025] 1、本发明的普特拉链霉菌（Streptomycesplatensis)F-l、普特拉链霉菌 (Streptomycesplatensis)UV-46、普特拉链霉菌（Streptomycesplatensis)3-10 的液体 培养物滤液对灰葡萄抱菌菌丝生长、抱子萌发和采后草替灰霉病发生的抑制作用。
[0026] 2、本发明的普特拉链霉菌（Streptomycesplatensis)F-l、普特拉链霉菌 (Str巧tomycesplatensis)UV-46、普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis)3-10 的液体 培养物滤液对核盘菌菌丝生长、菌核萌发和核盘菌菌丝对小白菜叶片侵染的抑制作用。
【附图说明】
[0027]图1为链霉菌F-I菌落、抱子丝及抱子形态特征图（PDA, 28°C，7d);图中，A，菌落 正面；B，菌落背面；C，抱子丝；D，抱子链及抱子；
[0028] 图2为紫外线照射时间与链霉菌F-I抱子死亡率的关系曲线；
[0029]图3为氯化裡浓度梯度和紫外线照射时间与链霉菌UV-46抱子死亡率的关系曲 线；
[0030] 图4为链霉菌F-1、UV-46、3-10的液体培养物滤液对灰霉菌菌丝生长的抑制作 用；
[0031] 图5为普特拉链霉菌F-I及诱变得到的普特拉链霉菌菌株UV-46和3-10的液体 培养物滤液对灰葡萄抱菌抱子萌发的抑制作用；
[0032] 图6为普特拉链霉菌F-I及诱变得到的普特拉链霉菌菌株UV-46和3-10的液体 培养物滤液对储藏期草替灰霉病的防治效果；
[0033] 图7为普特拉链霉菌F-I及诱变得到的普特拉链霉菌菌株UV-46和3-10的液体 培养物滤液对核盘菌菌丝生长的抑制作用；
[0034] 图8为普特拉链霉菌F-I及诱变得到的普特拉链霉菌菌株UV-46和3-10的液体 培养物滤液对核盘菌菌核萌发的抑制作用；
[0035] 图9为普特拉链霉菌F-I及诱变得到的普特拉链霉菌菌株UV-46和3-10的液体 培养物滤液对核盘菌侵染小白菜叶片的抑制作用；
[0036] 图10为普特拉链霉菌（Str巧tomycesplatensis) 3-10的液体培养物滤液的稀释 液对核盘菌侵染小白菜叶片的抑制作用，
[0037] 图中，10、50、100、500、1000为链霉菌培养物滤液的稀释倍数。
【具体实施方式】
[0038] 为了更好地解释本发明，W下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于W下实施例。
[0039] 实施例1普特拉链霉菌F-I的分离及鉴定
[0040] 一、菌株分离与筛选
[0041] 本发明的微生物是在湖北武汉地区水稻植株上分离到的一株具有较强括抗活性 的链霉菌。其分离方法为：将采回的水稻样品根部用自来水冲洗干净，去掉表面泥±。取 水稻的根、