一株用于生产固定化碱性果胶酶纳米微球的工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于固定化酶技术领域，设及一种一步法生产固定化碱性果胶酶的新方 法，特别设及一株用于一步法生产碱性果胶酶固定化纳米微球的工程菌及其构建方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 碱性果胶酶一般指聚半乳糖醒酸裂解酶巧.C. 4. 2. 2. 2,polygalac化ronate lyase,P化)，其最适抑值在8~10,可W在高抑条件下断开果胶聚合物主链，产生不饱和 的寡聚半乳糖醒酸。该酶在工业领域是一种重要的新兴酶类，广泛应用于诱导植物抗病、果 胶废水处理和咖啡茶的发酵等方面。近几年研究发现碱性果胶裂解酶是一种重要的清洁生 产用酶，主要运用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业，通过酶解精炼替代传统的纺织 精炼来解决环境和能源等问题，在质量与环保方面都具有传统工艺无法相比的优点。随着 碱性果胶裂解酶新用途的不断出现，市场对该酶的需求量越来越大，因此，碱性果胶醋裂解 酶是近年国外研究的热点课题。
[0003]为了提高碱性果胶酶的稳定性，促进其重复使用，便于连续的工业化生产，碱性果 胶酶的固定化一直是人们关注的热点。传统的碱性果胶酶固定化方法主要包括：吸附法、包 埋法、共价键结合法、交联法等。但传统的固定化方法各有利弊：①吸附法虽制作条件溫和、 简便、成本低，但酶与载体结合不牢，易脱落。②共价键结合法和交联法虽然酶与载体结合 牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。③包埋法虽未 受到化学反应影响，可W制得较高活力的固定化酶，酶也不易脱落，但将酶限制在一定的载 体内，使酶与底物结合的范围变小，影响了酶活性的发挥。同时，传统的固定化工艺大致可 W分为=步：酶的分离提纯，载体制备W及酶与载体的结合；工艺复杂，成本高，酶活力回 收率低。运些都限制了碱性果胶酶的工业化生产与应用。因此，探索廉价、高效、应用性强 的固定化碱性果胶酶生产的新方法，是打破目前固定化酶的技术瓶颈，解决固定化碱性果 胶酶工业化生产及应用的关键。
[0004] 聚径基脂肪酸醋（polyhy化oxygdkanoates，PHA)是很多细菌在营养失衡的情况 下合成的一种细胞内聚醋，球形，直径约50~300皿，该球形的细胞内聚醋由一个疏水的 PHA核屯、和由憐脂界膜及膜上嵌入或附着蛋白构成。PHA合成酶地aC是PHA生物合成和纳 米微球形成的关键酶，通过共价键与PHA分子主链合成末端相连，从而定位于PHA纳米微球 的表面。
[00化]近年来，随着分子生物学的发展，将外源功能蛋白与PHA聚合酶进行融合表达，在 重组微生物体内就能合成表面带有功能蛋白的纳米微球复合体，运样功能蛋白就高效地结 合到了纳米微球表面，形成功能性微球。由于纳米微球在微生物细胞内是W单独的包涵体 形式存在，因此通过细胞破碎和离屯、的方法就能简便、有效地使其从细胞中分离并得到纯 化。目前，通过将抗体结合结构域、生物活性多肤分子、抗原片段等与PHA聚合酶化aC的融 合表达，已成功制备了用于生物分离、蛋白纯化、药物传递、疾病诊断和酶的固定化的生物 活性微球，使其成为一种廉价、高效的蛋白固定化呈递新技术。
[0006] 目前，利用该技术进行固定化碱性果胶酶的一步法生产还未见报道。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有固定化酶技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一株用于一步法 生产碱性果胶酶固定化纳米微球的工程菌及其构建方法与应用。
[0008] 本发明通过W下技术方案来实现： W09] 本发明公开了一株重组大肠杆菌菌株，该大肠杆菌菌株命名为E.COli化21A值E3)pABC-P化，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中屯、，菌种保藏号 为CGMCCNO. 10911。
[0010] 本发明还公开了上述重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括W下步骤： W11] (1)将PHA前体合成酶基因地aAB、碱性果胶酶基因Pgl和连接肤linker的融合 基因Pg^linkerW及PHA合成酶基因地aC依次插入载体质粒pCD抑uet-1中，构建得到重 组质粒pABC-P化；
[0012] (2)将重组质粒pABC-P化转化大肠杆菌E.COli化21A值E3)，得到基因工程大肠 杆菌菌株E.COli化21A值E3)pABC-P化。
[0013] 碱性果胶酶基因Pgl选自枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis。
[0014] PHA合成酶基因地aC来源于Ralstoniaeutro地a。
[0015] 步骤（1)构建重组质粒pABC-P化的具体操作包括如下步骤：
[0016] 1)利用PCR扩增得到PHA前体合成酶基因地aAB，然后采用限制性内切酶切割载 体质粒pCD抑uet-1和PHA前体合成酶基因地aAB，将PHA前体合成酶基因地aAB插入载体 质粒pCD抑uet-1中，得到载体质粒pAB;
[0017] 2)采用限制性内切酶切割载体质粒pAB和基因Pgl-Iinker，然后将基因 pg；L-linke;r插入质粒pAB中，得到载体质粒pAB-P化；
[0018] 3)利用PCR扩增得到地aC基因，然后采用限制性内切酶切割载体质粒pAB-P化和 基因地aC，将基因地aC插入载体质粒pAB-P化中，得到重组质粒pABC-P化。 阳019] 所述碱性果胶酶基因Pgl和连接肤linker的融合基因Pg^linker的核巧酸序列 如SEQ.ID.NO. 1所示；PHA合成酶基因地aC的核巧酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。
[0020] 本发明还公开了基于上述公开的重组大肠杆菌菌株一步法生产固定化生产碱性 果胶酶纳米微球的方法，将重组大肠杆菌E.COli化21A值E3)pABC-P化菌株在矿物质培养 基中进行诱导表达培养后，再经分离提纯，获得碱性果胶酶纳米微球。
[0021] 所述将重组大肠杆菌E.COli化21A值E3)pABC-P化菌株在矿物质培养基中进行 诱导表达，具体操作为： 阳02引首先，将重组大肠杆菌E.COli化21A0E3)pABC-P化菌株在LB培养基中过夜培 养作为种子液，再按2 %的接种量将种子液接入装有IOOmLMM培养基的SOOmLS角瓶中， 其中MM培养基另加入Ig/L的葡萄糖、lOOmg/L的Str巧tomycin和0. 2g/L的IPTG，30°C、 200rpm/min的条件下培养48小时；
[0023] 其中0. 5g/L的葡萄糖、Str巧tomycin及IPTG在培养开始时加入，另0. 5g/L的葡 萄糖在培养24小时后加入。
[0024] 所述分离提纯，具体操作为：
[0025] 收集发酵液，离屯、，弃上清；用IOmM憐酸缓冲液对菌泥进行充分洗涂，再将菌泥重 悬于IOmM憐酸缓冲液中；然后，超声破壁处理20分钟；通过甘油密度梯度离屯、的方法从菌 体细胞裂解液中纯化微球，并用50mM憐酸缓冲液对纯化的微球进行充分洗涂，去除甘油残 留；最后经冷冻干燥得到碱性果胶酶固定化纳米微球固体粉末。
[00%]与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0027] 本发明通过基因重组的方法构建了一株重组大肠杆菌E.coli化21A值E3) pABC-P化，该重组大肠杆菌将目前工业上广泛应用的碱性果胶酶基因融合到PHA合成酶基 因地aC的C末端上，并将此重组基因片段转化至宿主菌中进行诱导表达，宿主菌体内就能 合成表面带有碱性果胶酶的纳米微球复合体，运样碱性果胶酶就有效地结合到了纳米微球 表面，形成固定化碱性果胶酶，一步实现碱性果胶酶的固定化生产。该方法具有W下优势：
[0028] 1、避免了传统方法的繁琐工序，使生产成本大大减低；
[0029] 2、酶通过共价键与载体PHA相连，结合牢固，不易脱落；
[0030] 3、酶在生产的同时实现固定化，酶的空间结构未受其他物理或化学因素破坏，制 得的固定化酶活力较高；
[0031] 4、酶连接在载体外部，酶与底物结合不受限，不影响酶活性的发挥；
[0032] 5、由于纳米微球W单独的包涵体形式存在于细胞内，通过细胞破碎和离屯、的方 法就能使其从细胞中分离，分离提取步骤简单、高效。 阳〇3引保藏说明
[0034] 本发明对所述的重组大肠杆菌E.COli化21A值E3)pABC-P化进行了下述保藏：
[0035] 保藏时间：2015年5月25日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC);保藏号为CGMCCNo. 10911。
[0036] 分类命名为：大肠埃希氏菌，Escherichiacoli。
【附图说明】
[0037] 图1为重组菌体内一步合成碱性果胶酶固定化纳米微球的模型图；
[0038] 图2为重组质粒pABC-P化构建的技术路线图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0040] 本发明提供的一步法生产碱性果胶酶生物固定化纳米微球的方法。参见图1，首 先碱性果胶酶基因P化通过一段连接肤融合到PHA合成酶基因地aC的N末端上，然后将此 重组基因片段转化至大肠杆菌中进行诱导表达，当PHA合成酶地aC在重组微生物体内合成 PHA微球时，碱性果胶酶P化也跟着一起负载到了PHA微球表面，成为固定化的碱性果胶酶 纳米微球一步实现碱性果胶酶的固定化生产。
[0041] 1、重组大肠杆菌菌株的构建
[0042] I.IPCR扩增地aAB基因和地aC基因
[0043] 根据地HR68质粒（含有来源于Ralstoniaeutropha菌株的地aABC基因簇，由 清华大学陈国强教授惠赠）中地aAB基因和地aC基因的DNA序列设计引物地aABEcoRI/ 地aABHind^I、phaCnosta;rt)(hoI/phaCstopAv;rII，分别扩增编码PHA前体合成酶基 因地aAB和编码PHA合成酶基因地aC。
[0044] 引物序列如下：
[0049] PCR反应体系（50iU) :5XSFBuffeHwithIOmMMgS〇4) :IOy1，dNTP MixQOmMeach):Ijil，地aABEcoRI/地aABHindIII:各Iyl或地aCnostartMiol/ phaCstopAvrII:各In1，PhantaSuperFidelityDNAPolymerase:0. 5yI， pBHR68:0. 3yI,DMSO:I. 5yI,孤Wupto50yI。
[0050] ?0?反应条件为：95°(：预变性5111111;95°(：变性3〇3,60°(：退火3〇3,72°(：延伸2111血 32个循环；72°C延伸5min。
[0051] I. 2人工合成碱性果胶酶基因pgl-linker。
[0052] 合成的Pgl基因序列参考NCBI中B.subtilispelgene(GenBank:X74880)，去掉 5'端的信号肤序列及3'端的终止密码子序列，并在3'端末尾加上一段由36个碱基编码的 12个氨基酸的柔性linker(GGGSGGGSGGGGS)，使Pgl基因和地aC基因用该linker连接在 一起。
[0053] 1. 3表达质粒pABC-P化的构建
[0054] 将扩增得到的地aAB基因片段用凝胶分离纯化后，经EcoRI、化ndIII酶双酶切，同 时用EcoRI、化ndIII双酶切表达载体pCD抑uet-1。双酶切后的PCR产物和载体经PCR产物 纯化试剂盒（generay，GK2051)回收。将回收到的PCR产物和表达载体22°C连接化，构建 表达载体pAB，然后转化大肠杆菌D册a感受态细胞，挑取阳性转化子，并对阳