一种产γ-环糊精糖基转移酶的重组大肠杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其是设及一种重组大肠杆菌及其在产丫 -环糊 精糖基转移酶方面的应用。
【背景技术】
[0002] 环糊精（简称CD)是环糊精糖基转移酶通过环化反应作用淀粉或者其衍生物后生 成的a-1，4-糖巧键连结而成的低聚糖化合物，一般由六个W上D-化喃葡萄糖单元构成。 最常见的CD是由六个、屯个或八个葡萄糖单元构成，分别被命名为a-、0-和丫-CD。在 S中常见的CD中，丫-CD具有更好的应用前景。与a-、P-CD相比，丫-CD具有更高的溶 解度（233g?kl，25°C)和更大的空腔，能够包合更大分子量的化合物，并改善运些化合物 的性质；此外，Y-CD安全性高，适合用做食品添加剂和胃肠外投药，因此它具有广阔的应 用空间。但是在现有的条件下，T-CD转化率低，产物特异性较差，导致成本太高，限制其大 规模应用。
[0003] 近年，为了克服天然菌株的丫-环糊精糖基转移酶低生产能力，丫-环糊精糖基转 移酶基因在基因工程菌中过量表达被认为是最有效途径之一。目前，一些丫-环糊精糖基 转移酶在枯草芽抱杆菌中实现了胞外表达，但表达量不是太大。而在大肠杆菌中虽然表达 量较大，但重组酶大多是W不溶性包涵体形式存在，即使一些策略能将其定位于周质空间， 周质中的酶液在工业上也很难大规模回收，运些都限制了重组丫-环糊精糖基转移酶的工 业应用。因此，构建用于大肠杆菌胞外分泌信号肤，提高丫-环糊精糖基转移酶胞外酶活， 对于丫-环糊精糖基转移酶工业化生产需求和降低成本有重要意义。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种产丫 -环糊精糖基转移酶的 重组大肠杆菌及其应用。本发明的化CD信号肤与常用的化IB信号肤相比，丫-环糊精糖 基转移酶酶活更高，解决了T-环糊精糖基转移酶胞外分泌量低的问题；应用本发明方法 生产丫 -环糊精糖基转移酶，产量高、工艺简化、便于工业化应用。 阳0化]本发明的技术方案如下：
[0006] 一种产丫-环糊精糖基转移酶的重组大肠杆菌，在丫-环糊精糖基转移酶基因与 T7启动子之间加入信号肤形成重组基因，将重组基因在宿主大肠杆菌中进行表达得到的重 组大肠杆菌；所述丫 -环糊精糖基转移酶的核巧酸序列是SEQIDNO. 5 ;所述信号肤的核巧 酸序列是沈QIDNO. 4。所述重组大肠杆菌的出发宿主菌是E.COliBL2UDE3)。
[0007] 所述信号肤的核巧酸序列沈QIDNO. 4可W由沈QIDNO. 2或沈QIDNO. 3所代 替。所述将重组基因在宿主大肠杆菌中进行表达得到的重组大肠杆菌是指：将所述重组基 因连接到表达质粒中形成重组质粒，再转化到宿主大肠杆菌中得到重组大肠杆菌。所述表 达质粒是：pET-20b(+)。
[0008] 所述的重组大肠杆菌的具体制备方法为：
[0009] (I)在SEQIDNO. 5所示核巧酸序列的丫 -环糊精糖基转移酶基因与T7启动子 之间加入SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的化IB信号肤，形成的重组基因（pET-2化(+)/ PelB-CGT)，W其为模板，用序列是SEQIDNO. 6所示引物对整个表达载体进行PCR;
[0010] 似将PCR产物用EcoRV、NdeI双酶切得到不含信号肤的重组基因 (pET-20b(+)/CGT);
[0011] (3)根据SEQIDNO. 4所示序列的信号肤设计引物为SEQIDNO. 9所示的核巧酸 序列，进行PCR，所得产物用EcoRV、NdeI双酶切，得到SEQIDNO. 4所示核巧酸序列的信 号肤；
[0012] (4)用连接酶连接步骤（2)的重组基因和步骤（3)的SEQIDNO. 4所示序列核巧 酸的信号肤得到重组质粒（pET-20b(+VDacD-CGT);
[001引 妨将步骤4得到的重组质粒转化到E.COli化21触如中，即得到重组大肠杆菌。
[0014] 所述的的重组大肠杆菌的应用为生产丫-环糊精糖基转移酶。
[0015] 所述重组菌的构建方法具体如下：依据合成的核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示的 来源于A化ali地ilicBacillussp.G-825-6的丫-环糊精糖基转移酶基因、核巧酸序列如 沈QIDNO. 1至沈QIDNO. 4所示的4种信号肤（分别命名为化1B，SufI,OmpA,DacD)设 计引物，采用PCR分别将信号肤添加到丫 -环糊精糖基转移酶基因与T7启动子之间获得重 组基因（PelB-CGT，SufI-CGT,OmpA-CGT,DacD-CGT);将所述的重组基因连接到祀T-20b(+) 表达载体，得到重组质粒；将所述的重组质粒热转化大肠杆菌E.COli化21 0E3)，获得重组 大肠杆菌工程菌株。
[0016] 本发明有益的技术效果在于：
[0017] 本发明通过构建含有胞外分泌信号肤的丫 -环糊精糖基转移酶重组基因，实现了 丫-环糊精糖基转移酶大肠杆菌高效分泌表达，解决了 丫-环糊精糖基转移酶产量低的问 题。核糖体合成的蛋白前体依赖SecB的途径跨内膜，定位到周质空间，最后成熟蛋白再分 泌到胞外。当成熟蛋白质N端前14位氨基酸为不折叠氨基酸时，才能被分泌到细胞外，而 不同信号肤引导蛋白质分泌的效率不同，一方面，可能是由于信号肤抑制蛋白质折叠的能 力不同，即维持胞内蛋白质处于分泌状态的能力不同；另一方面，由于成熟蛋白质与信号肤 N端带相反电荷，也许它们之间的静电相互作用有利于发卡结构形成，有利于疏水性区域插 入至细胞膜中，从而有利于分泌蛋白的有效分泌表达。化CD信号肤与化IB信号肤相比， 化CD信号肤抑制蛋白质折叠的能力更强，分泌表达效果更好。
【附图说明】 阳01引图1为实施例1~3克隆表达载体构建图；
[0019] 图2为实施例1~3重组大肠杆菌工程菌的丫 -环糊精糖基转移酶酶活；
[0020] 图3为实施例3的化CD信号肤序列分析。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。所述表达载体购自和宿主菌购 自TransGen公司。
[0022] 实施例1 :祀T-20b(+)/SufI-CGT重组质粒的构建
[0023]A化aliphilicBacillussp.G-825-6 丫-环糊精糖基转移酶基因全长 2097bp。根 据SEQIDNO. 2信号肤的核巧酸序列设计引物。如图1所示，经过PCR将信号肤序列与SEQ IDNO. 5所示的基因序列进行连接，获得重组基因片段，（1)WSEQIDNO. 5所示核巧酸序 列的丫-环糊精糖基转移酶基因与T7启动子之间加入了SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的 化18信号肤形成的重组基因（口61'-2化(+)/化18-〔61')为模板，用序列是56〇10^.6所示 引物对整个表达载体进行PCR;(2)PCR产物回收后用EcoRV、NdeI双酶切，得到不含信号 肤的的重组基因（pET-2化(+)/CGT) ;(3)根据SEQIDN0.2所示序列的信号肤设计引物为 SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列，进行PCR，产物回收后用EcoRV、NdeI双酶切，得到SEQ IDNO. 2所示核巧酸序列的信号肤；(4)用连接酶连接步骤（2)的重组基因和步骤（3)的 SEQIDNO. 2所示核巧酸序列的信号肤得到重组质粒（pET-2化(+VSufI-CGT);(5)将步骤 4得到的重组质粒热转化E.COliBL2UDE3)感受态细胞。转化液涂布含氨节（lOOug/mL) LB平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。测序工作由上海生工完成。
[0024]祀T-20b(+)/SufI-CGT重组菌的构建
[00巧]将含有丫-环糊精糖基转移酶基因前添加了信号肤的重组基因的重组质粒热转 化E.COliBL2UDE3)感受态细胞，具体方法如下：
[0026] 1)现将空2血离屯、管放入冰中预冷2min，然后从-70°C取出E.COliBL21值盼）感 受态细胞分装到2个离屯、管中，每管装45JiL;
[0027]。取预冷质粒10yL，2yL，与感受态细胞混合，注意操作轻柔，冰上放30min; 阳02引扣取1血的LB到离屯、管，42°C预热；
[0029] 4)将预冷的感受态+质粒的细胞迅速放入42°C水浴热击60s，迅速取出放入冰浴 Smin;
[0030] 5)向热击处理后的细胞里加LB培养基（42°C)500化，37°C，200巧m，l.化；
[0031] 6)将经培养的细胞5000r/min离屯、5min，弃掉400yL上清液；
[0032] 用枪头将泡在离屯、管底的菌重新悬浮，涂布在含氨节的LB培养基中，37°C，过夜。
[0033] 祀T-20b(+)/SufI-CGT重组大肠杆菌的摇瓶培养
[0034] 将本发明构建的工程菌作为生产菌株。种子培养液，接种10mL/50mL种子培养基， 37°C，200r/min培养她。发酵培养液，接种100mL/500mL发酵培养基，37°C，200r/min培养， 当菌体培养0D600 = 0. 6时，加入0.OlmMIPTG，并迅速转至18°C，200r/min，诱导表达16h。 测定丫-环糊精糖基转移酶酶活。种子培养基/发酵培养基（g/L):膜蛋白腺lOg/l，^Cl lOg/l，酵母粉 5g/L，pH7.0
[0035] 实施例2 :pET-20b(+) /OmpA-CGT重组质粒的构建
[0036]A化aliphilicBacillussp.G-825-6 丫-环糊精糖基转移酶基因全长 2097bp。如 图1所示，根据SEQIDN0.3信号肤的核巧酸序列设计引物。经过PCR将信号肤序列与SEQ IDNO. 5所示的基因序列进行连接，获得重组基因片段，（1)WSEQIDNO. 5所示核巧酸序 列的丫-环糊精糖基转移酶基因与T7启动子之间加入了SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的 化IB信号肤形成的重组基因（pET-2化(+)/化1B-CGT)为模板，用序列是SEQIDNO. 6所示 引物对整个表达载体进行PCR;(2)PCR产物回收后用EcoRV、NdeI双酶切，得到不含信号 肤的的重组基因（pET-2化(+)/CGT) ;(3)根据SEQIDN0.3所示序列的信号肤设计引物为 SEQIDNO. 8所示的核巧酸序列，进行PCR，产物回收后用EcoRV、NdeI双酶切，得到SEQ IDNO. 3所示核巧酸序列的信号肤；(4)用连接酶连接步骤（2)的重组基因和步骤（3)的SEQIDNO. 3所示核巧酸序列的信号肤