杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的特异性单克隆抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，特别设及 口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株W及该抗 体在检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthDisease,FMD)属一类传染病，俗名"口疮"、"辟療"，是 由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthDiseaseVirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、 热性、接触性传染病，其临床特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水瘤。口蹄疫病毒主要 侵害偶蹄兽，偶见于人和其它动物，其主要宿主包括猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生 偶蹄动物等，易感动物多达70多种，最易感染的动物是牛、猪、骆驼、羊、鹿等，野猪、野牛等 野生动物也易感染此病。口蹄疫传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成 巨大政治、经济损失。口蹄疫在亚洲、非洲和中东W及南美均有流行，在非流行区也有散发 病例。鉴于此，世界动物卫生组织（法语：〇fficeinternationaldesepizooties，0IE，也 称"国际兽疫局OI巧将其列为A类传染病之首。目前，有=分之二的OIE成员国流行口蹄 疫，时刻威胁着无口蹄疫国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
[0003] 口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水瘤，高烧不退，使实 际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和 集体焚毁染病牲畜W绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业 的"头号杀手"。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。
[0004] 口蹄疫病毒（FMDV)是偶蹄类动物高度传染性疾病（口蹄疫）的病原，属于微核糖 核酸（小RNA)病毒科（Picornaviridae) 口蹄疫病毒属（Aphthovirus),其最大颗粒直径为 23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米，在病毒的中屯、为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱 基组成，是感染和遗传的基础，周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学 反应能力，病毒外壳为对称的20面体。
[0005] 目前，口蹄疫病毒在全世界主要有0、4、(：、541'1、5412、5413(即南非口蹄疫病毒1、 2、3型）和Asial(亚洲1型）7个血清型，W及65个W上亚型。各型之间几乎没有免疫保 护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用多价疫苗 来降低患口蹄疫的风险。0型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主 要为0、A、CS型及ZB型（云南保山型）。口蹄疫0型包含多种毒株：0/GX/09-7、0/Mya98/ XJ/2010、0/Mya98/BY/2010、0/JMS/2000 等。其中，口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)病毒是由中国 兽医药品监察所提供，属于化thay拓扑型新猪毒，该毒株株对乳鼠的适应性较好，毒力较 强；在BHK-21细胞上适应性好，遗传稳定；对猪毒力较强；毒株具有较广的抗原谱；1毫升 抗原表达量可达3微克W上，每毫升TCIDs。可达10 7'5W上。
[0006] 目前，口蹄疫灭活疫苗是预防该病发生的主要有效手段，主要通过将口蹄疫病毒 体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。 阳007] FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。疫 苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终 消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在 预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV基因 工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肤疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫 苗、核酸疫苗等不断涌现。目前，常见的是口蹄疫多种毒株制备的多价疫苗，如口蹄疫0型 (0/GX/09-7)和口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)混合制备成的双组份疫苗。疫苗生产企业 目前常采用薦糖密度梯度离屯、法测量口蹄疫病毒的含量，但是无法对多价疫苗的某种毒株 进行单独定量。
[0008] 目前，对口蹄疫的检测和诊断，主要基于临床判断W及PCR分子检测。PCR是一个 高灵敏的方法，但特异性存在不足，对口蹄疫的确诊还需要配合核酸测序。因此，运个方法 成本高、操作复杂、对人员的要求也高。
[0009] 基于抗原抗体的免疫学检测，因操作简单、灵敏度高、特异性强、仪器设备便宜等 优点已经被广泛使用在临床检测上。目前，市场上偶见能够检测口蹄疫抗原的酶联免疫检 测试剂盒，但是大都采用了多克隆抗体制成，比如中国农业科学院兰州兽医研究所开发、生 产的0型口蹄疫146S抗原定量化ISA检测试剂盒，已提交专利申请（CN103076451A)，该试 剂盒采用了 0型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体制成，但是无法区分0型 的不同毒株，比如新疆株（〇/Mya98/XJ/2010株）和广西株（0/GX/09-7株），因而就无法对 多组份0型疫苗中的每种0型口蹄疫146S抗原进行单独定量，其主要的原因就在于多克隆 抗体针对多种抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的不同毒株之间可能会存在相 同的抗原表位。因此采用多克隆抗体去特异性检测口蹄疫不同的毒株是不可能成功的，尤 其是同一血清型不同的毒株。
[0010] 单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克 隆抗体，目前在很多临床检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但但尚 不足W应用到口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的检测，可特异性检测口蹄疫0型（0/GX/09-7) 病毒的单克隆抗体仍是研究方向。
【发明内容】
[0011] 本发明的第一个目的是提供用于检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的杂交瘤细胞 株及其产生的特异性单克隆抗体。
[0012] 本发明所提供的W口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、 稳定分泌抗口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为 抓6,该细胞株已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、，保藏编号为CGMCCNo. 11196。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0013] 由杂交瘤细胞株6D6分泌的特异性单克隆抗体命名为6D6anti，来源于小鼠属小 鼠（Musmus州Ius)，也属于本发明。
[0014] 6D6anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸残基序列或将序列 表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与 口蹄疫O型（O/GX/09-7)病毒特异结合的多肤，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo:2 的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基 的取代、缺失或添加且可与口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒特异结合的多肤。
[0015] 序列表中的SEQIDNo:1由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo:2由 99个氨基酸残基组成。
[0016] 编码单克隆抗体抓6anti的基因化D6anti)，其重链可变区编码基因具有序列表 中SEQIDNo:3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:1的DNA序列或在高严谨条件下可 与序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列杂交的核巧酸序列，其轻链可变区编码基因具有 序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高严谨条 件下可与序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列杂交的核巧酸序列；
[0017] 所述高严谨条件为在0.IXSS阳（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。 阳01引序列表中的SEQIDNo:3由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:1的 氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo:4由297个碱基组成，编码具有序列表 中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0019] 含有本发明基因抓6anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌均属于本发明。
[0020] 获得本发明的杂交瘤细胞株抓6的方法，可包括W下步骤：
[0021] 1)用口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒作为免疫原免疫动物； 阳02引。分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
[0023] 3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株抓6。
[0024] 获得特异性单克隆抗体抓6anti的方法，是在上述步骤的基础上增加W下步骤：
[0025] 4)从杂交瘤细胞株6D6的培养液或接种杂交瘤细胞株6D6的动物的腹水液中分离 并纯化出单克隆抗体。
[00%] 在上述方法中，步骤1)中的口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒可为活病毒或灭活病 毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000yg/mL;用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、 大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
[0027] 步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制 备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂（如聚乙二 醇）的诱导下与骨髓瘤细胞（优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合W形成杂交瘤。
[0028] 步骤3)中可W在选择性培养基（如HAT培养基）中培养W筛选融合的杂交瘤细 胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性 细胞株。
[0029] 步骤4)中可于体外（如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中）或体内（小鼠腹水） 培养分泌口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒单克隆抗体抓6anti的杂交瘤细胞株抓6,并从细胞 培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出特异性单克隆抗体6D6anti。
[0030] 本发明还提供特异性单克隆抗体抓6anti在口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的 ELISA检测中的应用，是用口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体抓6anti作为 包被抗体和酶标抗体的双抗夹屯、化ISA检测方法，可包括W下步骤：
[0031] 1)用特异性单克隆抗体抓6anti包被酶联板，洗板； W巧。封闭经包被的微孔板，洗板； 阳〇3引扣加待测样品，洗板；
[0034] 4)加辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧标记的单克隆抗体抓6anti， 洗板； 阳0对 W加底物显色；
[0036] 6)终止反应；
[0037] 7)测定0〇4加值。
[0038] 本发明另一目的是提供一种检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的化ISA试剂盒。
[0039] 本发明所提供的检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的化ISA试剂盒，包括用 6D6anti作为包被抗体包被的微孔板和用抓6anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
[0040] 所述用抓6anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用IOmMpH7. 0-7. 4PBS将 6D6anti稀释成0. 5-10y邑/111以加入微孔板中，110y1/孔，置于2-8°C过夜。拍干后，加入 含1%BSA的IOmM抑7. 0-7. 4PBS，300 ^1/孔。置于2-8°C过夜。拍干、干燥后真空装入 侣锥袋中备用。
[0041] 所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧等标记酶标记抗 体，然后用酶标记抗体