一种分隔固定多种酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及活性接枝交联聚合在聚合物基材表面分隔固定多种酶的方法。
【背景技术】
[0002]生物酶作为一种温和高效的催化剂在实验室研究以及工业化应用中都有着极其光明的前景。相比于化学反应而言，酶促反应的条件更加温和，操作更加简单，区域选择性更高，反应中副产物更少，而且很多化学方法难以合成的反应都可以通过一种或多种酶来完成。但是酶本身成本很高，游离酶稳定性较差，这成为阻碍其普及的瓶颈。为了进一步拓宽酶的应用范围，将生物酶固定化在基材上，具有以下优点:其一，固定化的基材由于和底物是分开的，因此可以避免酶对反应底物的混合污染；其二，由于酶本身价格昂贵，固定化酶可以实现对酶的回收利用，从而大大降低了反应的成本；其三，将酶固定化在基材表面可以增加酶的结构稳定性，使酶在实验室和工业化研究中更不易失活。
[0003]在形形色色的酶固定化载体选择上，以聚合物凝胶为载体的酶固定技术成为近年来的热点。但是，聚合物凝胶普遍存在机械强度较低的缺点，在实际应用中很容易被破坏而丧失其功能。除此之外，凝胶对外界环境比较敏感，在溶剂中易发生溶胀从而导致酶的泄露。为解决这些问题，使用可见光可控活性接枝的方法，在聚合物基材表面接枝一层致密而均匀的网布层，网布层相比于凝胶来说，溶胀性小，网络致密而均匀，包埋的酶不易发生泄漏。除此之外，由于聚合物基材与聚合物网布相似的柔韧度和卓越的机械强度，将网布接枝在聚合物基材上，制备具有支撑基质的聚合物网布/基材复合膜成为一种新型的制备高性能固定化酶的方法。
[0004]近年来，使用多种酶同时催化一个复杂体系的多种化学反应，或由一个起始物的多级转化反应是生物催化研究的热点方向之一，这就涉及到多酶的固定化技术。但目前专利和文献报道的大多是混合包埋法(这些酶之间不存在物理或化学负效应):比如牛军峰等(CN 102716684 A)将用于污水处理的多酶体系混合包埋在聚乳酸/嵌段共聚物凝胶之中，再将凝胶进行电纺丝制得纤维膜，使用此固定化酶膜催化多种污水中的含氨氮有机物，效率较高而且性能较好。吴敏等(CN 101914520 A)构建了纳米凝胶-多酶组装体系，对甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1，3_丙二醇氧化还原酶进行了固定，该方法成本低、反应简单，为多种酶提供了固定场所，是一种有效的纳米凝胶固定化酶催化合成的新方法。Zhao等(Green Chemistry, 2014, 16,2558)将葡糖氧化酶和葡糖淀粉酶混合固定在石墨稀氧化物上，利用该多酶共固定化的生物催化剂一步催化淀粉转变为葡萄糖酸的反应，两种酶的活性均保持在较高水平。
[0005]然而对很多复杂反应体系，当这些酶之间因存在物理或化学作用而互相影响生物活性时，需要分隔固定技术。如蛋白酶，当其与其他酶共同作用时，往往会分解其他酶(本质上是蛋白质)从而导致反应不能如期进行。但是，将相互抑制的多种酶分开固定在同一个基材上的报道则比较少见。
[0006]为解决将不同种酶特别是相互抑制的酶分开固定在同一基材上的问题，有必要设计出一种简单、条件温和的方法制备聚合物网布/基材复合膜，以实现在同一聚合物基材上对多种游离酶的分隔有效固定化。
【发明内容】
[0007]为克服上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种利用活性接枝聚合的特点在聚合物基材表面接枝多层网布层用以分别固定多种游离酶的方法。该方法操作简单，条件温和，能够在制备网布/基材复合膜的同时实现对多种游离酶的分隔包埋。并且以多种酶为模型来证明分隔固定的有效性。
[0008]该方法首先在紫外光照射下通过脱氢-偶联反应将光引发剂异丙基硫杂蒽酮(ITX)种植在聚合物基材表面形成ITX半频哪醇自由基(ITXSP)休眠种。接枝有休眠种的聚合物表面在可见光的照射下，休眠种发生断裂形成表面自由基和ITXSP，在加入可交联单体时，表面自由基可以引发表面接枝交联聚合，而ITXSP可以对聚合过程进行调控，从而形成致密而均匀的聚合物网布，接枝完毕后，ITXSP以休眠种的形式重新分布于网布表面上。
[0009]为了进一步解决酶分隔固定在同一基材上的问题，在进行可见光可控活性接枝聚合时，将酶A —同混入可交联单体溶液之中，伴随着接枝交联聚合的进行，酶A被原位包埋在新形成的致密而均匀的聚合物网络之中完成固定化。由于网布表面的休眠种可以在可见光照下再次断裂形成自由基再引发活性接枝交联聚合，当再次加入混有酶B的可交联单体溶液时，在包埋酶A的网布层之上，酶B被原位包埋在新形成的聚合物网络之中完成固定化。以此类推，一层包埋酶的网布之上接枝另一层包埋另一种酶的网布，形成一种层层结构，从而形成“酶大厦”。反应流程示意图如图1所示:
[0010]为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:
[0011]—种分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0012](I)将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的一侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射
1-5分钟，光强为0.9mff/cm2-9mff/cm2,引入表面可见光休眠基。
[0013](2)将含有游离酶A的单体可聚合溶液涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚合物膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯)下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，对酶A进行网布固定。
[0014](3)将含有游离酶B的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶A的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，在酶A网布层上对酶B进行网布固定。
[0015]进一步，步骤(I)中所述异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液浓度为0.5-4M。
[0016]进一步，步骤(I)中所使用的聚合物膜为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。
[0017]进一步，步骤⑵和(3)中所述的单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。
[0018]进一步，步骤(2)和(3)中所述的透光片为石英片或带有可透光图案化的掩膜。
[0019]进一步，步骤(2)和(3)中所述的可见光灯为氙灯或LED灯。
[0020]进一步，步骤(2)和(3)中所述单体可聚合溶液组成如下:酶质量百分含量为
0.01%-20%,可聚合单体的质量百分含量为20 %-60%,余量为水或pH范围为4_9的缓冲溶液。
[0021]另一种技术方案为:
[0022]将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的两侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/Cm2-9mW/Cm2，膜正反面皆引入表面可见光休眠基；之后将酶A的可聚合溶液涂覆在聚合物膜的一侧，将酶B的可聚合溶液涂覆在膜的另一侧，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，对酶A酶B进行分隔固定。
[0023]当然也可以进一步在两侧分别固定2种以上的不同的酶。
[0024]进一步，还包括以下步骤:
[0025]将含有游离酶C的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶B的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强0.3mW/cm2-3mW/cm2在酶B网布层上对酶C进行网布固定。或者更进一步，在包埋有酶C的网布层之上进一步分层固定不同种类酶。
[0026]本发明的优点在于:
[0027](I)酶的固定化在室温及可见光下进行，反应条件温和，有利于保持酶的活性。
[0028](2)网布/基材复合膜提高了酶自身结构和聚合物网布结构的稳定性，实现了酶的简单回收再利用。
[0029](3)活性接枝可以在一层包埋酶的网布层之上再次接枝一层新的包埋另一种酶的网布层，使多种酶分开固定在不同的网布层之中，这些不同种类的酶既可以共同催化同一个复杂的化学反应，又可以相互隔离避免相互抑制。
【附图说明】
[0030]图1.“酶大厦”的构建。(a) ITX通过脱氢-偶联反应种植在聚合物基材