用于从植物分离dna的非破坏性方法
【专利说明】用于从植物分离DNA的非破坏性方法
[0001]本申请是申请日为2007年2月14日、发明名称为“用于从植物分离DNA的非破坏性方法”的中国发明专利申请N0.200780005500.2的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及一种用于从植物分离DNA的非破坏性方法以及该方法在植物或植物种群的遗传分析中的应用。
[0003]发明背景
[0004]植物培育依赖于存在于具体作物物种生殖质中的遗传变异的有效开发，所述遗传变异决定了植物在特定环境的表型。然而传统上，通过在表型水平观察到的所期望的性状组合的挑选来实现，渐增地，可以通过基于在遗传上与促成特异性状表达的基因的等位基因型紧密连锁的分子标记的挑选来进行。
[0005]基于分子标记的性状挑选不依赖于植物的发育阶段，不依赖于环境，这显著提高了挑选过程。包括由多个基因控制的复杂性状在内的可以利用分子标记挑选的性状的数目大大增加，并且可以想象这一发展以渐增的速度持续。
[0006]植物培育领域中的另一个趋势起因于反向遗传学。反向遗传学涉及到一种方法，其中基因被分离，且基因的功能通过修饰它们的一级结构或表达来确定。随着目前在基因功能方面认识的增加，尤其是在模式系统中例如拟南芥(Arabidopsis tholiana)，反向遗传学方法现在在作物系统中增加了效力。
[0007]为了确定候选基因的等位基因变异性，过量的DNA诊断工具是可用的并为本领域技术人员所知。大量包含天然的或诱导的等位基因变异的植物种群需要在感兴趣的位点对DNA多态性进行筛选，以获得饱和的等位基因变异的采集。因而，可以通过关联分析评价如此发现的基因的等位基团型对植物表型的贡献。
[0008]筛选培育的或突变的种群的成本大部分由在研究过程中种植和采样种群的个体植物以及从这些样本中制备DNA所需的劳力所决定。在研究过程中，如果一个种群作为代表存在于种群的个体植物中的遗传变异的种子样本是可获得的，大量的劳力用于逐株收获种子作为家系中的相关个体。而且，这任务需要对产生的每一个额外种群进行重复，并时所述种群在特定遗传位点对等位基因变异进行评价。
[0009]发明概述
[0010]本发明的目的是提供一种用于从植物中分离DNA的有效的方法。本发明进一步的目的是提供一种有效的DNA分离方法，所述方法允许针对在特定遗传位点存在的等位基因变异进行植物种群的筛选，其需要人工解剖组织样本或需要收获来自被过量研究的种群的每个个体植物的种子。
[0011]根据本发明，发现这样的方法可以基于根部释放的分泌液的使用，优选地从很幼小的植物如幼苗的根部或从萌芽的种子暴露出的根部或生长在组织培养基里的植物的不定根，以从中分离DNA。更具体地，该方法利用从根尖分离的所谓的根边缘细胞作为DNA的主要来源。根边缘细胞是大部分植物物种围绕根顶端的活细胞。当生长在土壤里以及生长在液体或者固体培养基时，植物自然地从根部分离根边缘细胞。因此，本发明的方法被认为是非破坏性的。细胞已经以自然的方式从植物上分离，可以通过温和的搅动和去除围绕根部且包含根边缘细胞的培养基(通常是液体)而收获。生长的根部持续产生根边缘细胞，在稍后的时期可以再一次收获根边缘细胞。
[0012]因此本发明涉及一种用于从植物分离DNA的方法，包含:
[0013]a)从生长的根部收集根边缘细胞；和
[0014]b)从根边缘细胞提取DNA。
[0015]原则上，DNA可以从所有的根边缘细胞获得。但是，很实用的是收集源自萌芽种子部分的根部的根边缘细胞。种子能够在液体培养基如水中被浸渍，此后种子萌芽。因此能够在植物发育的很早的阶段，即种子发育期间，分析植物。没有必要等到叶子在植物上长出来。但是，该方法也可以在源自幼苗根部的根边缘细胞上进行。
[0016]进一步发现生长在组织培养基中的植物材料上的不定根产生根边缘细胞。根据本发明，这些根边缘细胞也可以用于从中分离DNA。
[0017]本领域技术人员所知的各种用于提取DNA的方法是可利用的，例如CTAB (Doyle JJand Doyle JL (1990) Focus 12, 13-15), KingFisher96? (Thermo Labsystems)等等。
[0018]如此获得的DNA可以是细胞核和细胞质来源的，并且可以用不同的核酸分析技术分析。这些核酸分析技术为本领域技术人员所熟知，包括但不仅限于聚合酶链式反应(PCR)，Sanger测序法，mini测序法，pyro测序法，GS20测序法，扩增片段长度多态性(AFLP)，限制片段长度多态性(RFLP)，随机扩增DNA多态性(RAPD)，Invader (侵染探针法)，寡核苷酸连接测定法(0LA)，单特征多态性(SFP)。
[0019]本发明进一步涉及新颖的非破坏性DNA分离方法在高效筛选大量植物种群在特定基因座的遗传变异中的应用。该遗传变异可以是自然的或人工诱导的。
[0020]因此从植物分离DNA的方法提供了一个获得可以用于检测由化学的或物理的诱变产生的植物种群中的特异基因的遗传变异的DNA的有效工具。可选择地，所述遗传变异可以存在于自然种群中。
[0021]本发明的方法的使用消除了建立衍生于发生突变的Ml植物的M2家系的需要。大量的M2种群可以被替代使用，使得可以用更加有效和灵活的方式分析M2种群的特异基因不同等位基团型的存在。
[0022]本发明的用于从植物分离DNA的方法也适合于在植物种群的遗传分型中使用，这对商业种子批次的质量控制目的以评价遗传纯度和同一性是有用的。
[0023]该DNA分离方法可进一步用于存在于遗传上截然不同的植物的种群中植物的鉴定，该鉴定基于检测多态分子标记的等位基团型，其中所述多态分子标记与决定某一个表型性状表达的基因的等位基团型是连锁的。
[0024]发明详述
[0025]大范围测序的成就提供了模式植物物种如拟南芥和作物物种如水稻的完整基因组序列。而且，对来自大范围作物物种如番茄，莴苣，黄瓜，芸苔，甜瓜，玉米等的不同组织样本来源的大量的cDNA片段或ESTs已进行了测序。目前的挑战是阐明单独的基因的功能，其表达的调节及其遗传交互作用。为了解决这个挑战，处理每个单独基因的大量的等位基因变异是重要的。这将为一个基因产物在细胞的，器官的或更高级别的水平发挥哪种生化作用和基因产物如何相互作用提供线索。
[0026]为了在植物培育中开发基因功能的信息，获得一个非常有效的，经济效益的反向遗传学技术是令人想要的。反向遗传学涉及一种方法，在所述方法中，以基因序列信息开始，针对该基因序列产生等位基因的或表达的变异体，随后对该突变体进行功能上分析。这个术语是相对于将表型变异作为起始材料以鉴定潜在的基因的等位基因型的正向遗传学的。
[0027]为了在植物培育中应用反向遗传学，基因功能的知识是先决条件。当前，拟南芥是最广泛研究的涉及基因功能的植物系统，来自拟南芥研究的结果在这方面提供了丰富的信息来源。
[0028]基于氨基酸序列水平的同源性，可以预测一个作物物种的同源蛋白的功能，尽管最终需要直接的实验证据以证实该基因的功能。因此，基于模式物种的基因的同源性而鉴定的作物物种的基因可以被认为是特异功能的候选基因。物种间的具有类似或相同功能的基因可以，但不必要，展现高水平的同源性，并且存在于一个具体模式系统的基因功能可能只是部分与存在于一个给定的作物物种的基因功能一致。
[0029]可以通过反向遗传学开发的等位基因变异性既自然地在适应的种群中出现又可以通过用化学的或物理的突变剂，分别例如甲基磺酸乙酯(ems)或X射线，的随机突变获得。通过用这些突变剂处理植物的器官，细胞，花粉或种子，将会在基因组DNA的随机位置引入可能导致基因功能改变的修饰。在基因功能方面迅速增加的知识，许多植物物种的基因组和cDNA序列的广泛可获得性和承载自然的和诱导的遗传变异的种群的可获得性的条件下，反向遗传学作为一种在模式或作物物种中确定基因功能的研究工具具有渐增的重大意义。另外，反向遗传学可以被认为是植物改良的有力的技术，用其可以有效鉴定已知的功能上与特异性状有关的基因的等位基因变异。
[0030]为了在一个作物物种中进行反向遗传学，除一个靶基因之外，明显地需要包含给定作物物种的遗传位点的遗传变异体的植物种群。在这些种群里，遗传变异可以是自然发生或可以是由突变剂如ems诱导的。为了获得带有诱导突变的种群，可以在包含不同浓度的突变剂如ems的溶液中温育例如种子。Ems首先烷基化DNA链的G残基，在DNA复制期间导致其与T配对，而非与C配对。因此，GC碱基对以一定频率变成AT碱基对，所述频率由ems的有效剂量和植物的错配修复系统的活性决定。
[0031]Ems的有效剂量依赖于所用的浓度，种子的大小