水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒的制作方法_2

文档序号:9541144阅读:来源:国知局
盒能快速鉴定样品是否含水貂源性成分;同时,能鉴别是否渗有兔源或狗源成分,为毛皮制 品的分子鉴定提供手段;另外,通过多重PCR检测,可一次性鉴别水貂、兔源和狗源成分,建 立肉类渗假和饲料成分鉴别的有效方法。基于此,本发明试剂盒及检测方法具有简便、快 速、全面、特异性强的特点,且成本较低,适用性广。
【附图说明】
[0052] 图1 :是SEQ ID No. 1所示的特异序列在水貂中具有物种特异性的检测结果。W關 科的水貂,非關科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、 兔、狐、狗、骆)W及非哺乳动物(鸡、鸭、碟)的基因组DNA为模板,扩增SEQ ID No.l所 示的的特异片段,所有测试样品中仅在水貂中得到扩增产物,非水貂均无扩增产物。结果 表明所扩增片段在水貂中具有特异性。泳道中编号说明如下:M :为BM2000 DNA Marker; 1-3 :空白对照;4-6 :水貂;7-9 :小鼠;10-12:大鼠;13-15:仓鼠;16-18:豚鼠;19-21:普通 牛;22-24 :水牛;25-27 :绵羊;28-30 :山羊;31-33 :猪;34-36 :马;37-39 :驴;40-42 :鸡; 43-45 :鸭;46-48 :碟;49-51 :兔;52-54 :狐;55-57 :狗;58-60 :骆子。
[0053] 图2 :是SEQIDNo. 1所示的特异序列在水貂不同DNA模板浓度中的灵敏度检测 结果。分别W0.Ing/yLIng/yL、IOng/yLIOOng/yL的水貂DNA为模板,扩增沈QID No. 1所示的特异片段,Ing/yL的模板浓度即有扩增,表明特异性引物所扩增片段具有较 好的灵敏性。泳道中编号说明如下:M:为BM2000DNAMarker; 1-4 :空白对照;5-8 :0.Ing/ yL的模板浓度;9-12 :Ing/yL的模板浓度;13-16 :IOng/yL的模板浓度;17-20 :IOOng/ yL的模板浓度。
[0054] 图3 :是SEQIDNo. 1所示的特异性序列在水貂的30个个体中的保守性检测结果。 W水貂DNA为模板,扩增SEQIDNo. 1所示的的特异片段,所有测试样品即所有水貂的样品 都得到特异性扩增,且一致性良好,表明所扩增片段在水貂中具有保守性。泳道中编号说 明如下:M:为BM2000DNAMarker;E:空白对照;N:多物种混合的阴性对照(无水貂DNA); 1-44 :水貂。
[0055] 图4:是水貂、兔、狗引物组特异性检测结果。分别用水貂、兔、狗的特异性引物在 该3个物种中进行扩增,结果各引物只在本物种中有效扩增,表明各特异性引物的特异性 良好。M:为BM2000DNAMarker出:空白对照;1 :水貂的特异性引物在水貂DNA中的扩增 结果;2 :水貂的特异性引物在狗DNA中的扩增结果;3 :水貂的特异性引物在兔DNA中的扩 增结果;4 :兔的特异性引物在兔DNA中的扩增结果;5 :兔的特异性引物在水貂DNA中的扩 增结果;6 :狗的特异性引物在狗DNA中的扩增结果;7 :狗的特异性引物在水貂DNA中的扩 增结果。
[0056] 图5:是水貂、兔、狗引物组多重PCR检测结果。取水貂、兔、狗W及S者等比例混 合的基因组DNA,用水貂、狗、兔混合引物化:5:2)进行检验,结果表明各引物特异性良好, 多重PCR检测可有效区分各物种条带。泳道中编号说明如下:M:为BM2000DNAMarker;E: 空白对照;G:狗阳性对照;S:水貂阳性对照;T:兔阳性对照;X:为水貂、兔、狗DNA等比例 混合样S重PCR结果。
【具体实施方式】
[0057]W下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制,在不背离本 发明精神和实质的前提下,对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。
[0058] 实施例1样品中水貂源性成分特异性检测
[0059]1.试样的制备与保存
[0060] 1. 1取样
[0061] 采集水貂样品Ig,于-20°C下保存备用。
[0062]1.2 DNA模板制备
[0063]DNA模板制备采用常用的苯酪-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂 斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999. 465-467) 或者公认的、具有相同效力的其他提取方法,运些方法都是报道的常用方法。 W64] 2.引物设计 W65] 本实施例的引物序列如表3和序列表SEQIDNO:2和3所示。
[0066] 表3本发明设计的PCR扩增引物
[0067]
[0068] 预期扩增片段大小为22化P,其核巧酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
[0069] 实验表明,该引物特异性强,在水貂中均能有效扩增,而在其他非水貂物种中都无 目的片段扩增;且引物的灵敏度较高,在模板DNA浓度为Ing/iiL时即可扩增。W上述引物 分别向3'、5'延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验,实验表明仍能进 行特异性扩增,从经济型和综合效果来看W表3中的引物最佳。
[0070] 3. PCR检测 阳0川 3.1试样PCR反应 阳07引 3. 1. 1在PCR反应管中依次加入反应试剂(如表1所示),混匀,再加25 y L石蜡 油(有热盖设备的PCR仪可不加)。
[0073] 3. 1.2将PCR管在离屯、机上500g~3OOOg离屯、10s,然后取出PCR管,放入PCR 仪中。
[0074] 3. 1.3进行PCR反应。程序为:95°C预变性5min;95°C变性30s,62°C退火30s, 72°C延伸15s,共进行30次循环;4°C降溫2min。 阳0巧]3. 1. 4反应结束后取出PCR管,对PCR反应产物进行电泳检测。
[0076] 3. 2对照PCR反应
[0077] 3.2. 1在试样PCR反应的同时,设置阴性对照、阳性对照、空白对照。各对照PCR 反应体系中,除模板外其余组分及PCR反应条件与3. 1相同,且阴性、阳性对照DNA模板浓 度也应达到试样DNA模板浓度要求。
[0078] 3.2.2 W非關科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猪、 马、驴、兔、狐、狗、骆)W及非哺乳动物(鸡、鸭、碟)的基因组DNA作为PCR反应体系的阴 性对照模板。
[0079] 3. 2. 3 W關科關属的水貂基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。
[0080] 3. 2. 4W双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。
[0081] 4.PCR扩增产物的检测及结果判定
[0082] 按30g/L的质量浓度称量琼脂糖,加入1X TAE缓冲液中,加热溶解,配制成琼脂糖 溶液。每IOOmL琼脂糖溶液中加入5yL邸溶液,混匀,稍适冷却后,将其倒入电泳板上, 插上梳板,室溫下凝固成凝胶后,置于1XTAE缓冲液中,垂直向上轻轻拔去梳板。取5 y L PCR产物与1yL加样缓冲液(称取250.Omg漠酪蓝,加入IOmL水,在室溫下溶解12h;称取 250.Omg二甲苯腊蓝FF,加10血水溶解;称取50.Og薦糖,加30血水溶解。混合W上S种 溶液,加水定容至IOOmU在4°C下保存)混合后加入凝胶点样孔,同时在其中一个点样孔中 加入DNA分子量标准,接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳15~30min后检测。
[0083] 电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA 分子量标准判断扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
[0084] 5结果分析与表述 阳0化]5. 1对照检测结果分析
[0086] 如图1所示,阳性对照的PCR反应中,水貂SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩 增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有 任何扩增片段,表明PCR反应体系工作正常。
[0087] 5. 2样品检测结果分析和表述
[0088] 5. 2.1若水貂SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩增,且扩增片段大小与预期 片段大小一致,表明样品中检测出水貂所述的特异性序列,表述为"样品中检测出水貂源性 成分"。
[0089] 5. 2. 2若水貂SEQIDNo.I所示的特异性序列未得到扩增,或扩增片段大小与预 期片段大小不一致,表明样品中未检测出水貂所述的特异性序列,表述为"样品中未检测出 水貂源性成分"。
[0090] 实施例2灵敏度试验
[00川分别W0.Ing/JiL、Ing/JiL、IOng/JiL、IOOng/JiL的水貂DNA为模板,按照实施例 1的条件,扩增SEQ ID NO. 1核巧酸特异片段。结果如图2所示,Ing/ y
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