超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，超声微泡介导的SiRNA干扰G服4在祀向调节尿钢 排泄及血压水平中的应用。
【背景技术】
[0002] 高血压及其并发症正成为影响人民健康的主要原因。肾脏是负责尿钢排泄的重要 器官，在高血压研究中得到普遍重视。在血压调控的众多因素中，G蛋白偶联受体激酶4佑 protein-coupledrec巧torkinases4,G服4)近年来尤其引人关注。首先，G服4定位于染 色体的4pl6. 3,运一区域被认为与人类原发性高血压的发病具有密切关系；而GRK4已知的 多个SNPs位点也与高血压的发病具有直接关联。其次，不同于G服家族其他成员，如G服2、 G服3、G服5和G服6的广泛组织表达，G服4的组织表达具有特异性，前期研究发现G服4特异 性的在肾脏、睾丸、子宫肌层和血管等有限组织中表达。更为重要的是，G服4可通过憐酸化 相应G蛋白偶联受体，改变相应受体的功能，比如：增加引起水钢滞留的血管紧张素II受体 I(ATiR)增加，并引起运些受体的憐酸化水平改变，进而使受体介导的肾脏排钢利尿受损/ 水钢滞留效应增强，从而引起血压升高。G服4活性增高是众多受体功能异常的原因，因此， G服4已经成为高血压治疗关注的新祀点。如何有效抑制G服4的活性及效应已成为高血压 研究与治疗领域的新的热点。
[0003] 随着人类基因组学和分子生物学的发展，与治疗相关的基因、受体、配体等被大量 发现，基因治疗高血压正逐渐成为目前国内外研究的热点。如何将目的基因安全、有效、祀 向性地导入体内特定器官、组织，并在祀细胞内稳定表达是目前亟待解决的主要难题之一。 目前基因转染方法可分为=类：（1)生物法：主要指病毒载体介导的基因转染；（2)化学法： 包括憐酸盐沉淀、脂质体包埋等；（3)物理法：包括电穿孔、裸露DNA直接注射等。其中，病毒 载体具有较高基因转染效率，但存在免疫原性及与宿主细胞整合的潜在危险，其安全性及 免疫原性所致的不良后果令人担忧。脂质体包埋等方法具有低毒、低免疫原反应等优点，但 有基因转染效率低、基因不能长期稳定表达等不足。电穿孔等物理方法对组织损伤大，且安 全参数难W确定。相比较而言，超声介导微泡破裂技术既安全又高效，应用前景令人期待。 具体地，超声介导微泡破裂（ultrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)技术 是将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在祀组织给予一定条件的超声照射，引起 微血管损伤，使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生"空化效应"和"声孔效应"，使毛细 血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入祀细胞，使微泡或释放的基 因能够进入血管壁及组织间隙，进而发挥祀向治疗作用。研究表明，联合使用超声照射和微 泡可明显提高基因的转染率。超声微泡技术具有3个特点：（1)安全性：超声造影剂是一种 高浓度微泡的混悬液，对人体无毒副作用；(2)祀向传输：采用治疗性超声或诊断性超声进 行照射，使微泡崩塌破裂后，祀向释放出所携带的基因；（3)促渗透作用：微泡破裂会产生 空化效应，导致膜通透性一过性升高，产生的微射流等可促进药物或基因运输。正是上述突 出优点，使得超声微泡技术显得格外引人关注。
[0004] 在超声微泡技术中，微泡是超声祀向造影剂的主要成分，包括外壳和内充气体。新 型微泡内充气体W六氣化硫、氣碳、氮等高分子惰性气体为主；包裹微气泡的外壳主要有脂 类、白蛋白类、多聚体类及表面活性剂类，可增加微泡稳定性，延长在血液循环系统中的停 留时间。近年来，在屯、血管疾病、糖尿病肾病或肾肿瘤中均有关于超声微泡介导的祀向治 疗，但是在肾脏尿钢代谢W及高血压研究领域中，超声微泡技术介导的基因治疗的应用尚 未见报道。 阳0化]RNA干扰（RNA inte计ering，RNAU可^高效的抑制特定基因，因其毒性较低，在 基因治疗研究中具有重要地位，技术也日趋成熟。SiRNA(small inte计ering RNA，SiRNA) 是RNAi作用的中屯、环节和效应分子。SiRNA的作用是W同源互补序列的mRNA为祀目标，促 使mRNA降解，可W高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱导基因沉默效应。依照此原理， 针对目标基因的信使RNA，设计并合成特异性SiRNA,可W封闭特定基因的表达。与其他基 因一样，SiRNA要成功运输，需经历3个阶段：细胞外运输、细胞摄取和细胞内运输。到目前 为止，在肾脏中尚未见利用SiRNA技术针对GRK4进行干扰，进而改变肾脏尿钢排泄水平的 报道。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超声微泡介导的SiRNA干扰G服4在祀向调 节尿钢排泄及血压水平中的应用，通过SiRNA干扰有效抑制肾脏G服4的表达，进而改变肾 脏尿钢排泄水平，降低血压。
[0007] 本发明采取W下技术方案：
[0008] 1、一 种SiRNA分子，序列为 5, -ccuguauucuuagaccaaa化化-3,、 5' -ggcugucug曰imimug曰曰曰dtdt-3' 或 5' -gg曰g曰g曰gcuccug曰曰guudtdt-3'。
[0009] 优选的，序列为 5, -ccuguauu州uagaccaaa化化_3,。
[0010] 需要说明的是，序列中，a、U、C、g为核糖核酸，t为脱氧核糖核酸，d即表示所述核 酸为脱氧核糖核酸。
[0011] 2、上述SiRNA分子在制备预防或治疗高血压的药物中的应用。
[0012] 优选的，所述SiRNA祀向干扰G蛋白偶联受体激酶4。
[0013] 优选的，SiRNA通过超声微泡携带。
[0014] 优选的，所述超声微泡为脂类微泡。
[0015] 优选的，所述超声微泡为脂膜微泡"脂氣显"，核屯、气体为全氣丙烷，微泡平均粒径 2ym，微泡浓度为4X1〇9~9X10 7ml。
[0016] 优选的，所述超声微泡先吸附一层多聚赖氨酸，再吸附siRNA。
[0017] 3、SiRNA分子在制备调节尿钢和/或尿量排泄的药物中的应用。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明采用超声微泡技术携带SiRNA至肾脏特异性破 裂，有效抑制肾脏GRK4表达，增加尿钢和尿量排泄，实现祀向预防和治疗高血压的目的。相 对于蛋白等其它材料来说，脂类微泡不会因高热而变性，回声性更强且易制备，其分子层的 可变性有利于特异性配体的偶联。超声微泡造影剂是一种良好的基因载体，与病毒载体相 比容量更大，可W携带寡反义核巧酸、DNA片段、甚至整个染色体，因此，在微泡上连接特异 性祀向配体或抗体构建超声祀向微泡，使微泡和祀器官之间结合更紧密，能更进一步提高 基因转染率，同时可减少对正常细胞、组织或血管的损害，并且在体内循环中更为稳定。
[0019]SiRNA技术能够克服反义寡核巧酸技术稳定性较差、转移系统对反义核酸的吸收 率较低、易引起毒性的缺陷，可W特异性剔除或降低特定基因的表达，具有高特异性（SiRNA 具有严格的序列特异性，其识别可精确到一个核巧酸）、高效性（只需少量SiRNA就可使作 用的编码基因产物显著下降）、高细胞穿透性（SiRNA抑制基因表达的效应可W跨越细胞界 限在不同的细胞间进行传递）等特点，已成为祀向基因治疗的有力工具。
【附图说明】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0021] 图1巧光酶标仪验证微泡包裹SiRNA,横坐标的"+ "代表加入了微泡，代表没 有加入微泡；纵坐标表示悬浮于液面的微泡的巧光值占总液体巧光值的比重。
[0022] 图2是3对不同的SiRNA对自发性高血压大鼠肾脏近曲小管细胞中G服4的mRNA 表达的干扰结果比较，1、2、3分别代表1-3号引物，效果最好的是1号引物。 阳02引图3超声微泡介导G服4siRNA(3号引物）干预自发性高血压大鼠后，其肾脏G服4 表达结果。
[0024] 图4超声微泡介导SiRNA干预自发性高血压大鼠肾脏G服4表达后，24小时尿量随 时间的变化结果。 阳0巧]图5超声微泡介导SiRNA干预自发性高血压大鼠肾脏G服4表达后，尿钢排泄率随 时间的变化