一种使用莲皮粉作为发酵原料制备丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本专利设及一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，属于生物工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] 莲皮粉是莲子加工和生产的的副产物。随着莲子产品需求增大，相关企业规模的 扩大和生产效率的提高，废料的处理问题也凸显出来。
[0003] 目前，对莲皮粉尚无有效的利用方式，对其研究也少有报道。根据有关资料表明， 可W其为原料发酵生产乙醇，或者采用适当的提取方法提取其中的功能成分，从而有效利 用废弃资源。
[0004] 下二酸（succinicacid)又名班巧酸，广泛存在于生物体中，是一种重要的二元有 机簇酸，也是微生物=簇酸循环糖酵解途径的重要代谢产物。下二酸在很多领域有着广泛 的应用，可用于合成可降解塑料，医药领域的镇定剂，食品工业的食品添加剂，表面活性剂 等。因此，下二酸的高效、低成本的生产方法也成为近年来研究的热点，其中采用生物发酵 的方法制备下二酸是重中之重。 阳0化]降低生物发酵法下二酸制备成本的一个主要方向是使用低廉的碳源，如何有效的 利用自然界的生物资源，既能满足人们正常的生活需求，又能降低对环境的污染是一个非 常有意义的课题。无疑，综合利用莲皮粉将对企业和社会具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于有效利用废弃资源，提供了一种使用莲皮粉作为发酵原料制备 下二酸的方法，使用莲皮粉作为生物发酵的碳源制备下二酸发酵液，降低了生物发酵法制 备下二酸的成本。
[0007] 本发明是通过W下技术方案予W实现的。
[0008] 一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1)莲皮粉的处理 ① 将莲皮粉用1%的氨氧化钢水溶液在120度条件下浸泡2小时，莲皮粉与氨氧化钢水 溶液的质量比为1: 3; ② 浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入巧樣酸或其他有机 酸调整溶液抑至4. 0~4. 5,溫度调整到38~40度； ③ 将诺维信纤维素酶Carezyme?45(K)L加入到经步骤（1)②处理的溶液中进行水解， 时间为48小时，诺维信纤维素酶Carezyme?450化的投加量为莲皮粉固体物中纤维含量的 10% ； ④ 将经过步骤（1)③处理的溶液中的固体滤除，并收集滤出液，此滤出液为纤维素酶水 解液，纤维素酶水解液中葡萄糖含量为2. 2%，木糖含量约为0. 4% ;将固体按固液质量比1 : 2加入去离子水，并使用Imol/L氨氧化钢调整PH值到5. 5~5. 8,加入诺维信a-淀粉酶，诺 维信a-淀粉酶的投加量为固体中淀粉含量的0. 05%，溫度升到95~100°C，进行淀粉液化得 液化液，液化维持时间为60~80分钟； ⑥将液化液降溫至60~65°C，调整PH值为4~4. 5,加入诺维信糖化酶进行糖化得糖化酶 水解液，糖化酶水解液中葡萄糖含量为8. 5%，诺维信糖化酶的投加量为固体物中淀粉含量 的0. 05%，糖化时间为24小时； ⑧将纤维素酶水解液与糖化酶水解液混合后浓缩至总糖含量为350g/L的水解糖液； (2)配置发酵培养基 采用去离子水配制发酵培养基IOOmU发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白 腺5g/l，玉米浆lOg/l，总还原糖含量lOOg/l，憐酸二氨钟2. 5g/l，憐酸氨二钢2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸钢1g/l，用去离子水配制，其中总还原糖取自水解糖液。
[0009] (3) -级培养 将班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593放入种子培养液中进 行培养，培养时间为14h。
[0010] (4)二级培养 一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到化后得培养液。
[0011] (5)S级培养 将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为0. 5~化/min,发酵过程中 流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值在5. 5~6. 5之间，溫度为 37~39°C，发酵时间为4她，发酵结束时钢离子浓度达到2. 5%，发酵结束后得下二酸。
[0012] 上述一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，优选地，所述发酵过 程中流加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值为6. 0~6. 2。
[0013] 上述一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其中，所述使用的纤维素 酶为诺维信纤维素酶Carezyme?4500L。
[0014] 上述一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其特征在于，发酵使用的 碳源为莲皮粉经过处理得到的纤维素、半纤维素水解后的产物。
[0015] 本发明的有益效果为： 通过对莲皮粉的预处理，将莲皮粉内的木质素去除，采用酸解和酶解将半纤维素和纤 维素转化为发酵下二酸所需的糖源，运对于降低生物法制备下二酸的原料成本有极大的作 用。利用生物法提取下二酸，安全环保。本发明采用莲皮粉生产下二酸，设计合理的工业步 骤，产出的下二酸杂质低，利用率高。生产成本低廉的同时，做到了降低对环境的污染的要 求。
【具体实施方式】
[0016] 实施例中所用到的莲皮粉，需对莲皮粉先进行检测，主要项目包括淀粉含量，粗纤 维含量，蛋白含量，灰分含量，水含量。
[0017] 淀粉含量的检测，主要是使用酸解的方法对淀粉进行水解，并通过DNS法对水解 液中的葡萄糖含量进行检测，再通过计算反推淀粉含量。
[0018] 蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法，参考GB/T5009. 5-1985。
[0019] 粗纤维的测定，是通过将定量的莲子粉在浓硫酸和重铭酸钟的混合液中进行氧化 分解，并使用硫代硫酸钢反滴过量的高儘酸钟的方法。
[0020] 水分的测定，采用直接干燥法，参考GB/T-14769-93。
[0021] 灰分的测定，参考GB5009. 4-85 根据W上方法的检测，本发明实施例中所采用的莲皮粉含有淀粉33. 5%，粗蛋白 11. 9%，粗纤维17. 56%，水分12. 69%，灰分4. 2%，另外还有22. 15%的组分不明，推测可能 为木质素。
[0022] 从上述结果可W看出，莲皮粉中可利用作为碳源的物质主要是淀粉和纤维素。
[0023] 本发明实施例中所使用的TSB培养液为膜蛋白腺大豆肉汤。
[0024]本发明所用菌株班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593， 已在中国专利化200610038113. 6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。 [00巧]下面结合实施例对本发明作进一步说明。 阳0%] 实施例1 一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1) 莲皮粉的处理 ① 称取100g莲皮粉，使用1%的氨氧化钢水溶液在120度条件下浸泡2小时，莲皮粉与 氨氧化钢水溶液的质量比为1: 3; ② 浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入巧樣酸调整溶液抑 至4. 0~4. 5,溫度调整到38~40度；③将诺维信纤维素酶Carezyme?450化加入到经步骤（1) ②处理的溶液中进行水解，时间为48小时，诺维信纤维素酶Carezyme?450化的投加量为莲 皮粉固体物中纤维含量的10%，质量为1. 7g; ④将经过步骤（1)③处理的溶液中的固体滤除，并收集滤出液，此滤出液为纤维素酶 水解液；将固体按固液质量比1 :2加入去离子水，并使用Imol/L氨氧化钢调整PH值到 5. 5~5. 8,加入诺维信a-淀粉酶，诺维信a-淀粉酶的投加量为固体中淀粉含量的0.05%， 质量为0. 〇17g;溫度升到95~100°C，进行淀粉液化得液化液，液化维持时间为60~80分钟； ⑥将液化液降溫至60~65°C，使用Imol/L的盐酸调整调整PH值为4~4. 5,加入诺维信 糖化酶进行糖化得糖化酶水解液，诺维信糖化酶的投加量为固体物中淀粉含量的0. 05%，质 量为0. 017g;糖化时间为24小时； ⑧将纤维素酶水解液与糖化酶水解液混合后浓缩至总糖含量为350g/L的水解糖液； (2) 配置种子培养基 配制种子培养液IOmU组成为蛋白腺5g/l，玉米浆20g/l，葡萄糖20g/l，憐酸二氨钟 1. 5g/l，憐酸氨二钢1. 5g/l，酵母膏5g/l，用去离子水配制。
[0027] (3)配置发酵培养基 采用去离子水配制发酵培养基IOOmU发酵培养基的组成成分按质量浓度计为：蛋白 腺5g/l，玉米浆lOg/l，总还原糖含量lOOg/l，憐酸二氨钟2. 5g/l，憐酸氨二钢2. 5g/l，酵 母膏5g/l，乙酸钢1g/l，用去离子水配制，其中总还原糖取自水解糖液。
[0028] (4)发酵培养基与种子培养基的预处理 将种子培养基和发酵培养基均在灭菌锅中，溫度121°C，灭菌20min。
[00巧](5)-级培养 将班巧酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes)CGMCC1593放入种子培养液中进 行培养，培养时间为14h。
[0030] (6)二级培养 一级培养后接种子培养基，接种量为4%，培养时间达到化后得培养液。
[0031] (7)S级培养 将培养液接入发酵培养基，在发酵罐中二氧化碳的通入量为化/min,发酵过程中流 加摩尔浓度为Imol/L的氨氧化钢溶液维持发酵系统的抑值在6. 0-6. 1之间，溫度为 37~39°C，发酵时间为4她，发酵结束时钢离子浓度达到2. 5%，发酵结束后得下二酸。 阳0巧 实施例2 一种使用莲皮粉作为发酵原料制备下二酸的方法，其制备方法如下： (1) 莲皮粉的处理 ① 称取100g莲皮粉，使用1%的氨氧化钢水溶液在120度条件下浸泡2小时，莲皮粉与 氨氧化钢水溶液的质量比为1: 3; ② 浸泡结束后，将固体滤出，使用去离子水清洗，冲洗至中性，加入下二酸调整溶液抑 至4. 0,溫度调整到38度；③