一种氰化物高效降解菌的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种氯化物高效降解菌的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002] 含氯废水泛指含有各种氯化物的废水。水体中的氯化物主要来源于氯化电锻、矿 物的开采和提炼、热处理、炼焦、摄影冲印、制药、合成纤维、电炉、煤气化、染料、制革、塑料、 钢锭的表面泽火W及工业气体洗涂等。当废水中氯处于合适的酸性范围内，会产生剧毒的 氨氯酸，因而含氯废水必须经过除氯处理才能排放。
[0003] 氯化物虽属剧毒物质，但某些微生物可W从氯化物中取得碳、氮养料，有的微生物 甚至W其作为唯一的碳源和氮源，在其代谢过程中将氯化物转化为二氧化碳、氨或甲酸、甲 酷胺等，从而使含氯化物废水具有可生物降解性。研究表明，生物法能够克服对金属氯络合 物脱除不彻底、处理费用高、产生余氯等缺点，因此，近年来利用生物法处理含氯废水取得 了较大的发展。
[0004] 由于可降解氯化物的菌株数量众多，所W通过定量测定氯化物降解菌的降解活性 来筛选高活性氯化物降解菌的菌株工作量巨大。目前，已有的几种主要能定性分析或鉴 定氨氮的显色技术，然后在此基础上进行定量分析，就会大大减少工作量，提高筛选效率。 普遍采用的初筛方法主要有W下几种：（1)《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》（町 535-2009) ; (2)《水质氨氮的测定水杨酸分光光度法》（町536-2009) ; (3)《水质氨氮的测 定蒸馈-中和滴定法》（町537-2009) ; (4)《水质氨氮的测定气相分子吸收光谱法》（町T 195-2005) ; (5)《水质氨氮的测定连续流动-水杨酸分光光度法》（町665-2013) ; (6)《水 质氨氮的测定流动注射-水杨酸分光光度法》（町666-2013)等方法。上述前S种方法耗 时长，不适合大量菌株的筛选工作，后两种测定方法需要购买昂贵的仪器设备，受到资金方 面的制约，所W，需要开发高效、简便、精准、快速的高通量筛选技术提高工作效率。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述【背景技术】中的不足之处，本发明提供了一种氯化物高效降解菌的高 通量筛选方法，包括步骤：S1、配制培养液；S2、将目标菌株接种于96孔板中；S3、往96孔板 中添加Sl中所配制的培养液；S4、往96孔板中添加显色剂。其中，步骤S2和S3无顺序先 后之分。
[0006] 本发明提供的氯化物高效降解菌的高通量筛选方法，其根据氯化物生物降解形成 游离态的氨或锭离子，可与纳氏试剂反应生成淡红栋色络合物来辨别氯化物的生物转化程 度，结合96孔板显色技术能对大量氯化物降解菌进行高通量快速的筛选，同时根据颜色深 浅能灵敏精确判断氯化物降解菌降解活性的高低，并可同时可定量判断菌株对氯化物的降 解量。氯化物被菌降解形成游离态的氨或锭离子，氨或锭离子可与纳氏试剂反应生成淡红 栋色络合物，红栋色的颜色越深，说明氨或锭离子的浓度越大，也就是说，同样的氯化物底 物，研究不同菌株对它的降解效果，氯化物降解菌对氯化物的降解效果越好，降解形成的游 离态的氨或锭离子越多，与纳氏试剂反应生成络合物的颜色也就越深。
[0007] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
[0008] 1.本发明利用96孔板对比颜色深浅来定性判断氯化物降解菌株降解性能的高 低，并可同时定量菌株对氯化物的降解量，对筛选氯化物降解菌较为灵敏和准确。
[0009] 2.《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》（町535-2009)中，当水样体积为 50ml，使用20mm比色皿时，方法的检出限为0. 025mg/L，测定下限为0.lOmg/l，测定上限为 2.Omg/L(均WN计）。而根据本发明所提供的方法，当水样体积为100y1，方法的检出限 为0. 002mg/L，测定下限为0. 05mg/l，测定上限为10.Omg/L(均WN计）。本方法的检出限 为町535-2009的十分之一，测定上限为的町535-2009的10倍，且一次可测定96个样品， 提高实验效率。
【具体实施方式】
[0010] 本发明提供了一种氯化物高效降解菌的高通量筛选方法，包括步骤：S1、配制培养 液；S2、将目标菌株接种于96孔板中；S3、往96孔板中添加Sl中所配制的培养液；S4、往96 孔板中添加显色剂和酒石酸钟钢溶液。其中，步骤S2和S3无顺序先后之分，显色剂和酒石 酸钟钢添加的顺序无先后之分。酒石酸钟钢在本发明中作为掩蔽剂，用于消除巧儀等金属 离子干扰。
[0011] 在一些实施例中，所述目标菌株为氯化物降解菌株。
[0012] 在一些实施例中，所述步骤S4还包括：往96孔板的各孔中添加酒石酸钟钢，在96 孔板的各孔中加入的酒石酸钟钢的含量为0-100yL。
[0013] 在一些实施例中，往96孔板的各孔中添加Sl中所配制的培养液，将目标菌株接种 于96孔板，并于15-38°C下，在所述培养液中培养24-4化。
[0014] 在一些实施例中，本发明所述培养液的PH为6. 5-8,优选地，每1000血本发明所述 的培养液中可含有浓硫酸4. 5-6mU在上述Kl值范围下更有利于本发明氯化物降解菌株的 生长。
[0015] 在一些实施例中，所述培养液按如下组成配制：巧樣酸钢，1. 5-2. 5g;皿2口〇4， 0. 9g;胞2册〇4 ? 12&0,6.Sg;(畑4)25〇4,〇. 3-0.Sg;M拆〇4 ? 7&0,0. 15-0. 25g;微量元素溶液， 0. 5-1. 5血；添加蒸馈水至1000血。进一步优选地，所述培养液可按如下组成配制：巧樣酸 钢，2g;皿2口〇4,〇. 9g;胞2册〇4 ? 12&0,6. 5g; (NH4)2S04,0. 4g;M拆〇4 ? 7&0,0. 2g;微量元素溶 液，1血；氯化物20-200mg;补足蒸馈水至1000血。
[0016] 在一些实施例中，所述氯化物选自络合氯、有机氯或者是无机氯中的一种或多种， 例如氯化钟或氯化钢。
[0017] 在一些实施例中，本发明所使用的微量元素溶液可使用市购产品，也可自制，例 如，所述微量元素溶液按如下组成配制：1血微量元素中含有化S〇4? 7&0,Ig;MnS〇4? &0， Ig;Na2Mo〇4 ?細2〇,〇- 25g;馬8〇4,0.Ig;CuCl2 ?細2〇,〇- 25g;ZnCl2,〇. 25g;順4 ?V〇3,0.Ig; Co(N〇3)2 ? 6馬0,0. 25g;NiS〇4 ? 6馬0,0.Ig。
[0018] 在一些实施例中，在96孔板的各孔中，加入的培养液的添加量为100-300yL目 标菌株的添加量为5-50yL显色剂的添加量为100-200yL。
[0019] 在一些实施例中，本发明所使用的显色剂可使用市购产品，也可按如下组成配制： l-20g氨氧化钢，0.Ol-IOg舰化钟，0.Ol-IOg舰化隶，5-lOOg酒石酸钟。进一步优选地，每 100血显色剂中包含：5-15g氨氧化钢，0. 5-5g舰化钟，0. 5-5g舰化隶，IO-SOg酒石酸钟。
[0020] 在一些实施例中，所述步骤S4显色时间为5-120min。
[0021] 在一些实施例中，本发明所提供的氯化物高效降解菌的高通量筛选方法还包括步 骤S5:在420nm波长处进行酶标仪的紫外吸收测定，OD(opticaldensity，光密度）值相对 高的孔对应的菌株即为筛选出的氯化物降解率高的菌株。
[0022] 数据处理、分析方法：称取3.819g氯化锭（NH4CI，优级纯，在100~105°C干 燥化)，溶于水中，移入1000 ml容量瓶中，稀释至标线，得到氨氮标准胆备溶液（PW= 1000yg/ml)。吸取5.OOml氨氮标准胆备溶液于500ml容量瓶中，稀释至刻度，得氨氮标准 工作溶液（PN=10g/mU(可在2~5°C保存1个月）。
[0023] 标准曲线的绘制：根据标准曲线计算氨氮含量及氯化物降解率。可按W下方法得 标准曲线：使用上述氨氮标准工作溶液，分别配制浓度PW为〇、〇. 05yg/ml、0. 1yg/ml、 0. 2yg/ml、0. 5yg/ml、0.8yg/ml、I. 0yg/ml、2. 0yg/ml、5. 0yg/ml、10yg/ml的氨氮标 准溶液，依次取上述氨氮标准溶液100y1、对应实施例中的显色剂50 ^^对应实施例中的 酒石酸钟钢溶液50yL于96孔板中，每样样品做3个平行实验，记录好各氨氮标准溶液与 96孔板相对应的编号。显色后，在最大吸收波长420nm处使用酶标仪测量吸光度。W浓度 P w(单位为yg/ml)为横坐标，吸光度（A)为纵坐标，绘制标准曲线。
[0024] 本发明提供的氯化物高效降解菌的高通量筛选方法，其根据氯化物生物降解形成 游离态的氨或锭离子，可与纳氏试剂反应生成淡红栋色络合物来辨别氯化物的生物转化程 度，结合96孔板显色技术能对大量氯化物降解菌进行高通量快速的筛选，同时根据颜色深 浅能灵敏精确判断氯化物降解菌降解活性的高低，并可同时可定量判断菌株对氯化物的降 解量。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
[0026] 1.本发明利用96孔板对比颜色深浅来定性判断氯化物降解菌株降解性能的高 低，并可同时定量菌株对氯化物的降解量，对筛选氯化物降解菌较为灵敏和准确。
[0027] 2.《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》（町535-2009)中，当水样体积为 50ml，使用20mm比色皿时，方法的检出限为0. 025mg/L，测定下限为0.IOmgA,测定上限为 2.Omg/L(均WN计）。而根据本发明所提供的方法，当水样体积为100y1，方法的检出限 为0. 002mg/L，测定下限为0. 05mgA，测定上限为10.Omg/L(均WN计）。本方法的检出限 为町535-2009的十分之一，测定上限为的町535-2009的10倍，且一次可测定96个样品， 提局实验效率。
[0028]