一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及纳米科技领域和酶活性检测方法领域，尤其设及纳米材料在生物酶活 性检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 酶制剂生产、应用和研究等各个环节都离不开酶活性的测定，如在发酵过程中通 过测定酶的活性W达到最大产酶量；在提炼过程中通过测定酶活性掌握酶的去向，W达到 最好的收率；在酶的应用过程中通过测定酶活性，W掌握好用酶量。因此，在酶制剂的生产、 应用和研究过程中准确测定酶活性都是十分重要的，开发简便、精确、快速的酶活性测定研 究方法具有重要的意义。
[000引 目前，分光光度法是检测生物酶活性最普遍的方法，一般选用3,5-二硝基水杨酸 值N巧作为显色剂。此方法的原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在沸水浴条件下 与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，还原糖的生 成量又与反应液中生物酶的活力成正比，通过分光光度计测定反应液的吸光度，从而计算 出反应液中生物酶的活力。虽然此法具有很好的操作性，但仍存在不足之处，例如显色剂 DNS溶液配制繁琐且等待时间长，需具备一定技术水平的专业人员配制，若试剂配制不成 功，直接影响实验结果。因此，寻找合适的试剂代替DNS显色剂，建立一种新的分光光度法 来检测生物酶的活性仍然是需要解决的问题。
[0004] 纳米材料是近年来的研究热点之一，W其独特的性能被广泛应用于物理、化学、电 子、材料等各个领域。其中，由于纳米金具有优异的光学性能，在生化分析领域得到广泛应 用。研究表明，在一定条件下，一些具有还原性的待测物能与氯金酸反应生成纳米金，使溶 液由无色或淡黄色转变为酒红色或紫色，且纳米金溶液的吸光度与待测物的浓度存在定量 关系。采用运种方法实现了神经递质、过氧化氨、抗氧化剂、0-兴奋剂W及四环素类抗生 素等多种物质的检测。本发明在上述工作的启发下，提出利用纳米金生长的反应检测生物 酶的活性。其原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在一定反应条件下与氯金酸反应 生成纳米金，在紫外-可见光谱中，纳米金溶液的吸光度与酶解产生的还原糖量成正比，还 原糖的量又与反应液中生物酶的活力成正比，从而计算出反应液中生物酶的活力。本发明 所建立的检测方法，可W作为现有生物酶活性检测方法的补充，丰富了酶活性的检测方法， 为酶的活性检测提供更多的选择。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的在于提供一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。
[0006] 本发明的目的通过如下技术措施来实现：
[0007] a、工作曲线的绘制：将糖类化合物标准品稀释成一系列的标准液，将一系列的标 准液分别与氯金酸反应形成不同浓度的纳米金溶液，通过测定各反应液的吸光度，得到糖 类化合物浓度与吸光度关系工作曲线。
[0008] b、酶解反应：在试管中加入W乙酸-乙酸钢缓冲溶液配制的底物溶液Vi血，置于 水浴中预热5min，加入酶稀释液V2mL得到混合液，将混合液在水浴中反应30min后，取 V3yL混合液加入1支新的试管中，然后与氯金酸反应，并使溶液的总体积为V4yL;上述酶 解反应做3次平行实验，测定结果取平均值。
[0009] C、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量适宜波长条件 下混合溶液的吸光度值，根据溶液吸光度与工作曲线确定酶催化底物水解所产生的还原糖 的浓度；定义Ig固体酶粉（或者ImL液体酶）在适宜条件下，每分钟水解底物溶液释放 1ymol还原糖所需的酶量为一个活力单位（IU)，根据如下公式计算生物酶的活力：
W11] 其中，X为生物酶的活力（IU) ;P为标准曲线上对应的还原糖的浓度（g/L) ;C为酶 液的原始浓度（g/L) ;t为酶反应时间（min) ;M为还原糖的摩尔质量；￥1、￥2、乂3、乂4如上文6 所述；1〇6为转化因子；Df为酶液稀释倍数。
[0012] 优选的，本发明所述的糖类化合物与氯金酸反应的条件为：反应混合液中含氯金 酸l-2mM，十六烷基S甲基氯化锭（CTAC)或十六烷基S甲基漠化锭（CTAB) 3. 6-12mM，W及 氨氧化钢3-5M;反应混合液于70°C反应10-15min。其中，氯金酸的量与还原糖相比大过量， W保证还原糖反应完全；CTAC或CTAB能防止生成的纳米金聚沉，起到增敏剂的作用；氨氧 化钢对于还原糖与氯金酸的反应起到关键作用，在氨氧化钢存在的条件下氯金酸能将还原 糖中的醒基氧化为簇基，而自身被还原为纳米金。
[0013] 优选的，本发明所述的酶活性检测方法适用于满足下列条件的所有生物酶活性的 检测，即在一定反应条件下，底物不与氯金酸反应，而酶解产物与氯金酸反应生成纳米金。 例如，采用本发明所述的酶活性检测方法测定纤维素酶的活性，底物为簇甲基纤维素钢，W 葡萄糖代表还原糖做工作曲线；测定木聚糖酶的活性，底物为木聚糖，W木糖代表还原糖做 工作曲线；测定淀粉酶的活性，底物为淀粉，W麦芽糖代表还原糖做工作曲线；测定甘露聚 糖酶的活性，底物为甘露聚糖，W甘露糖代表还原糖做工作曲线。
[0014] 优选的，本发明所述的糖类化合物标准品、底物、生物酶样品均W抑=4. 5-5. 5的 乙酸-乙酸钢缓冲溶液配制，W满足酶催化底物反应的最佳抑条件。
【附图说明】
[0015] 图1是发明原理示意图。
[0016] 图2是不同浓度葡萄糖与氯金酸反应后，溶液颜色变化图（从左到右葡萄糖的浓 度分别为：〇. 025,0. 042,0. 058,0. 075,0. 092g/L)
[0017] 图3是不同浓度葡萄糖与氯金酸反应后，溶液吸光度变化图（从a到e葡萄糖的 浓度分别为：〇. 025,0. 042,0. 058,0. 075,0. 092g/L)
[0018] 图4是葡萄糖浓度与溶液吸光度线性关系图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] 实施例1用于说明当本发明所提供的方法用于检测纤维素酶活性的效果。
[0021] a、工作曲线的绘制：将葡萄糖标准品稀释成一系列的标准液，在70°C水浴条件 下，与含有氯金酸ImM,十六烷基S甲基氯化锭3. 6mM，W及氨氧化钢4M的溶液混合反应 15min，得到深浅不同的紫色溶液（图2)。待冷却至室溫后测定波长为550nm处各反应液的 吸光度Am。、，得到葡萄糖浓度与吸光度关系工作曲线（图4)。 阳02引 b、酶解反应：W抑值4. 6的乙酸-乙酸钢缓冲溶液配制浓度为1 %的簇甲基纤维 素钢溶液。称取纤维素酶样品0.lOOOg，W抑值4. 6的乙酸-乙酸钢缓冲溶液溶解，在常 溫下磁力揽拌30min左右，定容至100血，备用。取3支试管，分别加入1 %的簇甲基纤维素 钢溶液1. 5mU置于40°C水浴中预热5min，加入酶稀释液0. 5mU将混合液在40°C水浴中反 应30min后，各取200yL混合液分别加入3支新的试管中，在步骤a的反应条件下与氯金 酸反应，并使溶液的总体积为2400yL。
[0023] C、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量波长为550nm 处反应液的吸光度为0.