用于检测mthfr基因多态性的引物对、荧光探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单核苷酸多态性检测领域，特别涉及用于MTHFR基因C677T位点核苷 酸多态性检测的引物对组、探针、荧光PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类基因组DNA中5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate-reductase，MTHFR)是叶酸和甲硫氨酸在人体内代谢途径中的关键酶之一，可将5, 10-亚甲 基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。一方面作为甲基的传递体参与体内嘌呤和嘧啶的合 成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅 酶，使血液中的同型半胱氨酸再甲基化生成甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸 水平。
[0003] 研究发现，MTHFR基因C677T位多态性可导致MTHFR的耐热性和活性下降，从而引 起同型半胱氨酸甲基化受阻，出现高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可损伤血管内皮 细胞，并引起低密度脂蛋白氧化和血小板凝集，从而破坏血管平滑肌细胞的正常功能及机 体的凝血和纤溶系统，从而加速动脉粥样硬化和血栓形成，引发多种疾病，如脑卒中、Η型高 血压、冠心病等。同时发现，高同型半胱氨酸血症可引起细胞死亡、诱导DNA链断裂、氧化应 激和细胞凋亡，干扰胚胎细胞的正常周期和诱发胚胎细胞凋亡，从而引发出生缺陷的发生。
[0004] 此外，MTHFRC677T基因多态性影响叶酸的正常代谢，从而增加叶酸拮抗剂的毒副 作用。甲氨蝶呤是抗叶酸代谢药物，是目前很多肿瘤（急性细胞性白血病）和风湿病的一线 用药，临床用药过程发现相同剂量的甲氨蝶呤用在不同的患者身上时其毒副反应不一。研 究结果表明677位TT纯合子对氨甲喋呤治疗的毒性反应比677C的基因型严重得多。
[0005] 另外，C677T基因多态性还影响到5-氟尿嘧啶的化疗效果。5-氟尿嘧啶为嘧啶类 似物，属于抗代谢药的一种，对消化道癌及其他实体癌有良好疗效。5-氟尿嘧啶对胃肠道肿 瘤化疗效果的研究发现，677位TT基因型携带者化疗有效率显著高于TC和CC基因型携带 者。
[0006] 由此可见，通过对个体MTHFR基因C677T位点基因型进行检测可以提示个体发生 脑卒中等心脑血管疾病及新生儿缺陷的风险，并预测甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶等化疗药物 的治疗疗效和毒副作用。
[0007] 对于该突变位点的检测，目前主要有Sanger测序法、PCR-RFLP法 (CN01105305. 5)、芯片法、荧光定量PCR法（CN201410767859. 5)等方法，然而上述检测方 法存在检测过程繁琐，周期过长，成本较高，判读复杂或者易引起交叉污染而出现假阳性以 及灵敏度低等缺点。现有技术中也公开了采用PCR-FRET法对突变位点进行检测，例如CN 201210356878.X公开了一种判断MTHFR基因多态性（C677T)的方法，设计一对用来扩增目 标序列特异引物和一对作为目标序列的检测信号FRET探针，两个独立的特异寡核苷酸序 列都标记上荧光基团。当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号，FRET探针再进行熔解 曲线分析，通过熔解曲线来判断MTHFR基因多态性（C677T)。该方法无需开管操作，且易于 判读，然而，上述方法需设计两条不同的FRET探针才能进行检测，检测程序复杂，且增加了 成本。
[0008] 针对这些问题，本发明设计了一种采用新的引物对和双标荧光探针的MTHFR基因 多态性检测方法，该方法简单、快速、价格低廉且易于判读，可用于临床检测。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种新的简单、快速而准确的用于检测MTHFR基因C677T 位点多态性的产品。
[0010] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点 多态性的引物对，所述引物对是用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸 序列组⑷和⑶之一：
[0011] ㈧正向引物具有序列表中的SEQIDN0 :1所示的核苷酸序列，SEQIDN0 :1 : 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3',
[0012] 反向引物具有序列表中的SEQIDN0:2所示的核苷酸序列，SEQIDN0:2: 5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，；
[0013]或者，
[0014] (B)正向引物具有序列表中的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，SEQIDNO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,，
[0015] 反向引物具有序列表中的SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，SEQIDNO:4: 5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3, 。
[0016] 本发明引物对也可为本发明上述寡核苷酸序列组（A)或（B)的互补序列。
[0017] 本发明还提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧 光探针含有以下寡核苷酸序列之一：
[0018] 荧光探针具有序列表中的SEQIDN0:5所示的核苷酸序列，SEQIDN0:5: 5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3' ，
[0019] 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，SEQIDNO:6: 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3' ；
[0020] 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，SEQIDNO:7 :5'-TGT CTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
[0021] 荧光探针具有序列表中的SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，SEQIDNO:8 :5'-TGT CTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3' 。
[0022] 本发明所述探针序列也可为上述寡核苷酸序列（SEQIDNO:5至SEQIDNO:8)的 互补序列之一。
[0023] 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双 标记探针。
[0024] 优选的，所述5'末端区域具有以下荧光基团之一：FAM，TET，VIC，HEX，R0X，J0E， CY3或CY5等；所述3'末端区域具有以下猝灭基团之一：BHQ，DABCYL或TAMRA等。
[0025] 本发明还一方面提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒，所述 试剂盒包括本发明上述任意引物对和荧光探针。
[0026] 进一步的，本发明所述试剂盒还包括PCR缓冲液。
[0027] 其中，在本发明【具体实施方式】中，本发明试剂盒中PCR缓冲液含有Mg2+。
[0028] 优选的，本发明所述试剂盒还可包括阴性对照品和/或阳性对照品。
[0029] 在本发明【具体实施方式】中，所述阴性对照为水。
[0030] 本发明所述试剂盒还可包括核酸DNA提取试剂。所述提取试剂按W:V比包含5~ 10% Chelex-100,其中，本发明所述的Chelex-100是一种由苯乙稀、二乙稀苯共聚体组成 的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子。
[0031] 本发明所述试剂盒还可包括PCR反应所需的Taq聚合酶、dNTP等，此外，还可包括 说明书。
[0032] 本发明还一方面提供了一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的PCR试剂， 所述PCR试剂包括本发明所述的引物对、焚光探针和PCR缓冲液。
[0033] 在本发明具体的实施方式中，所述引物对中各引物和探针在PCR试剂中的浓度 为：正向引物的终浓度为0. 08-0. 25μM，反向引物的终浓度为0. 82-1. 55μM，和/或，荧光 探针的终浓度为0. 05-0. 09μΜ。
[0034] 在本发明【具体实施方式】中，所述PCR试剂还可包括Taq酶、dNTP等。本发明PCR试 剂中Taq酶、dNTP的浓度的确定对于本领域技术人员来说可以根据所掌握的普通技术知识 确认，本发明对此不作限定。
[0035] 此外，本发明还提供一种本发明所述引物对、荧光探针、试剂盒或PCR试剂在制备 用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的试剂盒中的应用。
[0036] 本发明还一方面提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，包括以 下步骤：
[0037] 步骤（1)、提供一种用于扩增MTHFR基因的特异性引物对，含有以下寡核苷酸序列 组㈧和⑶之一：
[0038](A)正向引物具有序列表中的SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，SEQ ID N0 :1 : 5'-GAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3',
[0039] 反向引物具有序列表中的SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:2: 5,-GGACGATGGGGCAAGTGAT-3，；
[0040]或者，
[0041](B)正向引物具有序列表中的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:3: 5,-GAAGCACTTGAAGGAGAA-3,，
[0042] 反向引物具有序列表中的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:4: 5,-GTGTCAGCCTCAAAGAAA-3，；
[0043]步骤（2)、提供一种用于检测MTHFR基因C677T位点多态性的荧光探针，所述荧光 探针含有以下寡核苷酸序列之一：
[0044] 荧光探针具有序列表中的SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:5: 5'-TCTGCGGGAGCCGATTTCATC-3'，
[0045] 荧光探针具有序列表中的SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:6: 5'-TCTGCGGGAGTCGATTTCATC-3'；
[0046]荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO :7 :5' -TGT CTGCGGGAGCCGATTTCATCATC-3'，或者，
[0047] 荧光探针具有序列表中的SEQ ID NO :8所示的核苷酸序列，SEQ ID NO :8 :5' -TGT CTGCGGGAGTCGATTTCATCATC-3'；
[0048] 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双 标记探针；
[0049]步骤（3)、加入待测样品和步骤