卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中muc5ac表达的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卷烟烟气毒理研究技术领域，具体涉及一种卷烟烟气中芳香胺类化合 物体外诱导上皮细胞中MUC5AC表达的检测方法。
【背景技术】
[0002] 慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范围 内一种发病率高、致残致死率高、且严重影响患者生活质量的疾病，同时会加重患者的经济 负担。
[0003]在各种致病因素中，吸烟是最重要的环境危险因素。据统计，由吸烟所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。国外有80 %~90 %的C0PD是 由吸烟引起的，我国约有72%的C0PD是由吸烟引起的。
[0004] 正常情况下，气管、支气管上皮细胞和黏膜下腺分泌的黏液能保护气道上皮免受 空气污染物和病原体的攻击，而在慢性气道炎症性疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘等病理情 况下，常常伴有黏液过度分泌，过多分泌的黏液阻塞气道，使呼吸功能长期不能改善，且易 导致病原菌定植，引起反复感染，与病情严重程度密切相关。
[0005] 大量研究证实，气道黏液高分泌已成为coro急性加重期患者死亡率升高的独立 危险因素，在致死性哮喘患者气道中也发现有大量黏液阻塞，杯状细胞急性脱颗粒释放大 量黏液是造成哮喘急性恶化及死亡的重要原因。早有研究证实，吸烟患者的慢性支气管炎、 肺气肿、支气管哮喘、肺间质纤维化等一系列慢性炎性病变的发生率远远高于非吸烟者，且 病情更严重，不易缓解。
[0006] 长期大量吸烟的正常人中，虽然小气道形态学上并无异常，但上皮细胞中编码细 胞因子、固有免疫反应、凋亡、黏蛋白等的基因都存在调节上的异常，更易发生病变，导致 C0PD的发生发展。吸烟者气道的杯状细胞大量增生、肥大，其体积和数量多于吸烟者的数 倍，能储存高于正常2. 2倍乃至更多的黏液，在有小气道阻塞性病变的吸烟者中尤其显著， 故在急性发作期，更易产生黏液栓，使病情恶化。
[0007] 卷烟烟气是多种化合物组成的复杂混合物，截止1988年（据Roberts， 1988TobaccoR印orter报道）已经鉴定出烟气中的化学成分已达5068种，其中1172种是烟 草本身就有的，另外3896种是烟气中独有的。美国健康基金会副董事长D.霍夫曼博士列 出卷烟烟气中的44种主要有害成分，除焦油、烟碱和一氧化碳这些主要成分外，其他大致 可分为九类：①氨；②四种芳香胺；③苯并芘；④八种醛酮类化合物；⑤氢氰酸；⑥七种无 机元素；⑦七种酚类化合物；⑧四种烟草特有亚硝胺；⑨其他挥发性有机成分。
[0008] 国内的郑州烟草研究院根据国家局要求以及行业质量安全性工作的需要，推出卷 烟烟气中7种主要有害成分包括C0,HCN，NNK，NH3,B[a]P，苯酚和巴豆醛的行业标准。芳香 胺类物质作为烟气中主要成份之一，对呼吸道具有强刺激作用以及致癌作用，目前针对卷 烟烟气中芳香胺类物质体外诱导气道上皮Muc5ac表达，尚无公开发表的研究。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中MUC5AC表达 的检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中各种芳香胺类 物质对人气道上皮细胞中MUC5AC表达的诱导作用。
[0010] -种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中MUC5AC表达的检测方法， 包括：
[0011] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有MUC5AC启动子的MUC5AC-promotor-pGL6质 粒；
[0012] 步骤2,将MUC5AC-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到 MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞；
[0013] 步骤3,在MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合 物，作用至少48h ;
[0014] 步骤4,对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性， 得到上皮细胞中MUC5AC的诱导表达倍数。
[0015] 本发明选取人气道上皮细胞中MUC5AC启动子序列-1300-+48作为靶标序列，利用 PCR扩增该序列，并克隆到具有荧光素酶报告基因和G418筛选标记的PGL6质粒中，将测序 验证正确的质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，将转染后的细胞与卷烟提取物相作用， 获得上皮细胞中MUC5AC的表达程度。
[0016] 作为优选，MUC5AC-promotor_pGL6质粒的构建方法如下：
[0017] 步骤1-1、设计MUC5AC启动子-1300-+48的引物序列如下：
[0018]上游引物为：5'-AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3'（序列如SEQIDN0:1 所示的 DNA序列）；
[0019]下游引物为：5'-CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3'（序列如SEQIDN0 :2所 不的DNA序列）；
[0020] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增MUC5AC启动子序 列；
[0021] 步骤1-2、利用Κρη I和Xhol I双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用 T4DNA连接酶连接至少24h，得到MUC5AC-promotor-pGL6质粒。
[0022] 作为优选，步骤1-1中PCR反应的条件如下：
[0023]
[0024] 变性、退火、延伸循环28~30次。
[0025] 作为优选，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。
[0026] 作为优选，利用Lipofectamine3000转染试剂将MUC5AC-promotor_pGL6质粒转染 入人气道上皮细胞16HBE中，然后采用G418筛选得到MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞。
[0027] 作为优选，步骤3中，芳香胺类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16HBE产生 细胞毒性的最大量。
[0028] 本发明提供的检测方法，具有以下优点：
[0029] (1)由于卷烟烟气进入人体气道后主要作用细胞，本发明采用人气道上皮细胞作 为研究对象，更接近吸烟的实际状态。
[0030] (2)特异性的选取人气道上皮细胞中MUC5AC的启动子序列，使检测更加具有针对 性和特异性。
[0031] (3)建立MUC5AC-promotor-PGL6-16HBE稳转细胞，不用反复瞬时转染质粒，使筛 选更加快速和经济。
[0032] (4)采用荧光素酶报告基因作为最终检测指标，灵敏度高。
【附图说明】
[0033] 图la表示1-氨基萘对16HBE的细胞毒作用；
[0034] 图lb表示3-氨基联苯对16HBE的细胞毒作用；
[0035] 图2a表示1-氨基萘对16HBE中Muc5ac表达的诱导作用；
[0036] 图2b表示3-氨基联苯对16HBE中Muc5ac表达的诱导作用；
[0037] 图3为PGL6质粒图谱；
[0038] 图4表示卷烟提取物对人气道上皮细胞中Muc5ac的诱导作用。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1
[0040] 芳香胺类物质是卷烟主流烟气中的主要物质之一，主要有如1-氨基萘，2-氨基 萘，1-氨基联苯，3-氨基联苯等。为检测这些芳香胺类物质是否是吸烟导致肺部炎症的主 要化合物，对1-氨基萘和3-氨基联苯是否会诱导人气道上皮细胞中MUC5AC的表达进行检 测，包括以下步骤：
[0041] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有MUC5AC启动子的MUC5AC-promotor-pGL6质 粒，构建方法如下：
[0042] 步骤1-1、设计MUC5AC启动子-1300-+48的引物序列如下：
[0043]上游引物为：5 ' -AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3 ' ；
[0044]下游引物为：5' -CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3' ；
[0045] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增MUC5AC启动子序 列。
[0046] PCR反应体系包括：
[0047]
[0048] PCR反应的条件如下：
[0049]
[0050] 将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶，110V，20min电泳分离后，得到的扩增条带中的目 的条带约680bp切下，用GelExtractionKitDNA纯化试剂盒进行纯化。
[0051] 步骤1-2、采用ΚρηI和XholI双酶切纯化产物5h，同时采用ΚρηI和XholI 双酶切2μg质粒载体pGL6 5h，再次纯化回收后，用T4DNA连接酶在16°C下连接24h。
[0052] 连接反应体系如下：
[0053]
[0054