家蚕抗血液型脓病的snp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家蚕抗血液型脓病的SNP分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 家香血液型胺病是由家香核型多角体病毒（BombyxmoriNuclearPolyhedrosis ViruS，BmNPV)引发的对蚕桑生产危害最严重的病害，该病传染性极强，难以控制，常给蚕桑 生产造成巨大的经济损失，据统计每年该病对养蚕业的损失占蚕病总损失的50%以上，有 的地方高达80%，甚至出现颗粒无收的严峻局面。本申请人从几百份种质资源中筛选获得 了对BmNPV具有高度抵抗性的特殊种质材料，幼虫2龄起蚕对BmNPV的LC50达到109PIB/ ml，比常规品种高3~4个数量级，经遗传分析其抗病性受显性主效基因控制。为此，我们 设计将具有抗病主效基因的载体品种与现行实用家蚕品种杂交，导入抗病基因，成功培育 出经济性状优良的抗BmNPV病家蚕品种。抗病品种先后在我国十三个省市区进行了试养， 受到广大蚕农及生产推广部门的欢迎，受到同行专家的高度肯定。
[0003] 常规的鉴定家蚕品种是否抗脓病的方法是经口添饲或者穿刺感染家蚕核型多角 体病毒（BmNPV)，然后再跟踪调查死亡率得出各品种抗脓病性能。由于受病毒（新鲜度、纯 度）、温度、季节以及操作方法等多方面条件的影响，实验结果往往误差较大。而分子标记检 测技术则不受时空限制，可以快速、准确地对抗病材料进行鉴定、筛选及遗传分析。近20年 来，各国的科技人员从不同的家蚕品种资源中鉴定了多种抗血液型脓病的分子标记，少数 分子标记也已被应用到家蚕抗病育种中。SNP是染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起 的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式，广泛用于群体遗传学分 析、构建遗传连锁图和指纹图谱以及分子标记辅助育种等。2008年，Yamamoto等构建了拥 有1755个SNP标记的家蚕SNP连锁图，该图覆盖了家蚕的全部28个连锁群。因此，利用对 BmNPV具有高度抵抗性的特殊种质材料、家蚕基因组精细图、基因芯片以及SNP连锁图等数 据资源，构建家蚕抗血液型脓病品种的指纹图谱，对家蚕抗血液型脓病的检测及抗病品种 培育具有重要的科学及应用价值。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题：本发明提供一种家蚕抗血液型脓病的SNP分子标记及其应用， 通过检测这些SNP标记的组合，可以准确判断某个家蚕品种或遗传材料是否具有抗血液型 脓病性能，大大加快抗病品种的选育进程。
[0005] 技术方案：一种家蚕抗血液型脓病的SNP分子标记，所述SNP在家蚕第27连锁群 上，它们分别是chr27-10850279-A、chr27-13227410-G、chr27-13560821-C。
[0006] 鉴定权利要求1所述家蚕品种抗血液型脓病的分子标记的引物对，它们分别是 chr27-10850279引物对：SEQIDNo·l~2;chr27-13227410引物对：SEQIDNo·3~4; chr27-13560821 引物对：SEQIDNo. 5 ~6。
[0007] 所述分子标记在鉴定家蚕品种抗血液型脓病中的应用。
[0008] 所述引物对在鉴定家蚕品种抗血液型脓病中的应用。
[0009] 鉴定家蚕品种抗血液型脓病的试剂盒，检测对象为所述的分子标记。
[0010] 鉴定家蚕品种抗血液型脓病的试剂盒，含有上述的引物对。
[0011] 有益效果：开发了基于家蚕简并基因组测序获得的SNP标记，构建了家蚕抗血液 型脓病品种的SNP指纹图谱，利用这些SNP标记组合能够对家蚕抗血液型脓病品种进行检 测、筛选，提高了家蚕抗血液型脓病育种的效率。
【附图说明】
[0012] 图1为SNP-31Chr27-13227410A/G的验证电泳图及测序结果；chr27是家蚕第27 号染色体，13227410为SNP在染色体上的位置，A/G为SNP为突变形式；该位点在非抗病品 种中为A，而在抗病品种中突变为G。
[0013] 图2为SNP-5Chr27-10850279G/A的验证电泳图及测序结果；chr27是家蚕第27 号染色体，10850279为SNP在染色体上的位置，G/A为SNP为突变形式；该位点在非抗病品 种中为G，而在抗病品种中突变为A;
[0014] 图3为SNP-38Chr27-13560821C/A的验证电泳图及测序结果，chr27是家蚕第27 号染色体，13560821为SNP在染色体上的位置，C/A为SNP为突变形式；该位点在非抗病品 种中为C，而在抗病品种中突变为A。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1
[0016] 1、抗脓病品种特异性SNP分子标记的获得
[0017] 基于SLAF-seq技术对12个不同的家蚕品种出个抗脓病品种和6个非抗脓病品 种）进行简并基因组测序，共获得超过1万个SNP位点，分布在家蚕28个连锁群上。分析 所有的SNP标记，发现除第27连锁群（chr27)以外的所有连锁群上，SNP标记在抗性品种 和非抗性品种中无规律可寻，而在chr27上获得50个SNP标记，这些SNP标记在所有抗性 品种中呈现完全相同的碱基，而非抗病性品种中则呈现不同的碱基。
[0018]
[0020] 2、SNP多态性引物设计
[0021] 根据公布的家蚕基因组精细图中chr27的基因组信息、基因芯片以及SNP连锁图 等数据资源【家蚕基因组数据库（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)】设计相应的引 物对不同样品蚕的DNA进行PCR扩增。部分引物见表2。
[0022] 表.2验证的SNP多态性引物
[0023]
[0024] 3、利用引物组合对不同家蚕样品DNA进行PCR扩增
[0025] 取以上6个家蚕品种（3个抗病品种baiyuN、871N、872N以及它们对应的baiyu、 87U872)的2龄起蚕，提取样品蚕的基因组DNA，利用表2引物组合进行PCR扩增。
[0026] PCR反应体系为
[0027]
[0028] PCR反应条件为
[0029]
[0030] 4、PCR产物的验证
[0031]PCR扩增产物在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后割胶回收，测序检测， 与基于SLAF-seq技术对12个不同的家蚕品种进行简并基因组测序的结果比对。结果显示， 所有3个抗性品种的PCR扩增产物表现一致，即在SLAF-seq技术测序得到的SNP位点上呈 现出与测序结果的完全吻合，而3个非抗性品种则表现出不同的SNP标记，呈现出各位点上 的SNP多态性。
[0032] 结果见图1、图2、图3。
[0033]
【主权项】
1. 家蚕抗血液型脓病的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP在家蚕第27连锁群上，它 们分别是chr27-10850279-A、chr27-13227410-G、chr27-13560821-C。2. 鉴定权利要求1所述家蚕品种抗血液型脓病的分子标记的引物对，其特征在于它们 分别是chr27-10850279引物对：SEQIDNo·l~2;chr27-13227410引物对：SEQIDNo·3~ 4 ;chr27-13560821 引物对：SEQIDNo. 5 ~6。3. 权利要求1所述分子标记在鉴定家蚕品种抗血液型脓病中的应用。4. 权利要求2所述引物对在鉴定家蚕品种抗血液型脓病中的应用。5. 鉴定家蚕品种抗血液型脓病的试剂盒，其特征在于检测对象为权利要求1所述的分 子标记。6. 鉴定家蚕品种抗血液型脓病的试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的引物对。
【专利摘要】家蚕抗血液型脓病的SNP分子标记及其应用，所述SNP在家蚕第27连锁群上，它们分别是chr27-10850279-A、chr27-13227410-G、chr27-13560821-C。开发了基于家蚕简并基因组测序获得的SNP标记，构建了家蚕抗血液型脓病品种的SNP指纹图谱，利用这些SNP标记组合能够对家蚕抗血液型脓病品种进行检测、筛选，提高了家蚕抗血液型脓病育种的效率。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105296628
【申请号】CN201510738627
【发明人】徐安英, 钱荷英, 李刚, 李龙, 孙平江, 张月华, 刘明珠
【申请人】江苏科技大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月3日