瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所用芯片探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害检测领域，特别是瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及 所用芯片探针。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术的发展，植物病害的检测技术由传统的形态学鉴定发展到现 在的分子检测水平，从检测的速度、灵敏度准确性等各个方面都有很大的进步。血清学检 测、普通PCR检测技术、荧光PCR检测技术的应用使得病害的检测在灵敏度、特异性、准确性 上更进一步，但这类检测技术已不能完全满足大量、快速、灵敏对植物病害检测的要求，基 因芯片技术的出现，将样品检测和分析过程实现连续化、集成化和微型化，且具有高通量、 高灵敏度检测水平，能够同时对多种样品中多种病原进行检测。
[0003] 基因芯片技术是20世纪90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术， 是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表 面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析。它是一种快 速、高效、高通量分析生物信息的工具。基因芯片在核酸序列测定、基因突变的检测、基因表 达情况的分析、疾病诊断、病原菌检测、药物开发和筛选等诸多领域的研究中得到了广泛应 用，受到人们的普遍重视。当前随着经济全球化和世界贸易量的持续增长，一些病原微生物 也开始快速流行。
[0004] 瓜类是我国重要的经济作物。随着我国近年来对外贸易的快速发展，瓜类种子进 口量逐步上升，有害生物随进境瓜类种子传入我国的可能性加大。在引种的过程中加强对 病原物的检疫，防止疫病传播蔓延是我们的重要工作之一。因此建立快速、高效、灵敏、特异 的检测方法对加强进出口瓜类种子检疫有十分重要的意义。
[0005] 甜瓜黑点根腐病菌（MonosporascuscannonballusP.)、瓜蔓枯病菌 (MycosphaerellamelonisC·)、瓜炭疽病（Colletotrichumorbiculare)、黄瓜黑星病 菌（Cladosporiumcucumerinum)、黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsissclerotioides)这类 真菌，瓜细菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliW.)、瓜细菌性角斑病菌 (Psendomonassyringaepv.lachrymans)这类细菌以及南瓜花叶病毒（Sqashmosaic virus)、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreen mottlemosaicvirus)这类病毒是危害瓜类的重要病原物。在新疆局瓜种子出口贸易中， 这10种病害每年都有上百批的的检测需求，在面对大量检测样品时，尤其在同一样品要求 检测多种病害的情况下，难以实现高通量快速同步多病害检测，尤其是真菌、细菌病害分离 周期非常长，经验要求很高，阳性样品确定难度大，灵敏度不高，极大的影响了最终的检测 结果。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法及所 用芯片探针，本发明能实现检验检疫准确、快速、简便、高通量的技术要求。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种瓜上10种病害的微阵列芯片，该芯片包 含如下寡核苷酸探针中的至少一类（涉及瓜炭疽病菌时，瓜炭疽病菌Τ-GAPDHx、瓜炭疽病 菌T-GSx必须同时使用）；
[0018]黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-Px:GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。
[0019] 本发明还同时提供了利用上述芯片进行的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方 法，对每个待测样品依次进行以下步骤：
[0020] 1)、提取待测样品的DNA;配置成浓度为5_20ng/μ1作为模板；
[0021] 2)、引物荧光标记PCR反应：
[0022] 反应体系 25μ1 :10XPCRBuffer2. 5μl，25mMMgCl2 2. 5μ1，dNTP0· 5μ1， 1(^1上下游引物各0.54 1，51]/^1丁&9〇嫩聚合酶0.2以1，模板1.(^1;
[0023]PCR反应程序：预变性 94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°C30s，共 35 个循环；最 后 72°C延伸lOmin;
[0024] 上下游引物分别为以下（每种病菌对应一套引物，即具体为：瓜炭疽病菌对应2对 引物，其余病菌对应1对引物）：
[0025] 瓜蔓枯病菌Db-3x:CGTAAGTAGACCTCCACCAC
[0026] Db-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；
[0027]甜瓜黑点根腐病菌Mc-lx:CATTAAAGAGTTATCCAACTCC
[0028]Mc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；
[0029]瓜炭疽病菌GAPDH-3x:CCCTTCATTGAGACCAAGT
[0030] GAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；
[0031]瓜炭疽病菌GS-3x:TTCGTTCTCGAACACGAT;
[0032]GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；
[0033]瓜细菌性果斑病菌aac-lx:CTGGGAGCGATCTTCATC
[0034] aac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；
[0035]黄瓜黑色根腐病菌Phs-lx:CAACCACTCCCTCCCTT;
[0036] Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；
[0037]黄瓜黑星病菌Cc-3x:ATCGAGAAGTTCGAGAAGG;
[0038] Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；
[0039]瓜细菌性角斑病菌Psl-lx:GGCGACGCAATCAATGAT;
[0040]Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；
[0041]黄瓜花叶病毒CMV-lx:TCCGAGGAATTAAATGTTGA;
[0042]CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；
[0043]南瓜花叶病毒SqMV-lx:ACTTTGAAGTGGCTGGAAA;
[0044]SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；
[0045]黄瓜绿斑驳花叶病毒Cgmmv-lx:CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG;
[0046]Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；
[0047] 备注：上游引物标记Cy3;
[0048]3)、将步骤2)所得的至少2种病菌对应的PCR扩增产物等体积混合；
[0049] 备注说明：假设当为瓜炭疽病菌和另一种病菌时，共获得3种PCR扩增产物，将此 3种PCR扩增产物按照1:1:1的体积比进行等体积混合；其余依次类推；
[0050] 4)、芯片杂交与洗涤：
[0051] 将步骤2)所得的每种病菌对应的PCR扩增产物（备注说明：当为瓜炭疽病菌时， 由于其有对应2对引物，因此，需要将2对引物所对应的PCR扩增产物等体积混合；其余病 菌，均只有一种PCR扩增产物）或者将步骤3)所得的混合物95°C变性5min，然后冰浴5min; 得预处理后PCR扩增产物；
[0052] 然后将上述预处理后PCR扩增产物进行芯片杂交与洗涤；所述芯片杂交为45°C杂 交lh;
[0053] 5)、芯片扫描，获得检测结果。
[0054] 作为本发明的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法的改进：
[0055] 步骤5)为：
[0056] 以每条探针重复点的均值计算信号强度值；若肉眼观察有信号，信号绝对值大于 500,信噪比大于3,判为阳性；若信号绝对值小于500,信噪比小于2,判为阴性；如果信号模 糊，信噪比介于2和3之间，判为可疑，需重复实验进行验证。
[0057] 作为本发明的瓜上10种病害的微阵列芯片检测方法的进一步改进：
[0058] 步骤4)中，芯片杂交时所配制的杂交反应液为：6μ1预处理后PCR扩增产物， 300ηΜ杂交阳性对照1μ1与7μ1杂交液充分混合；
[0059]所述杂交液为：2· 5 % 甲酰胺，2XSSC/4XSSC/6XSSC/8XSSC/10XSSC(优选 6XSSC)0. 2%SDS〇
[0060] 举例备注说明：2. 5%甲酰胺，2XSSC，0. 2%SDS，即为：在100ml的2XSSC中加入 2. 5g甲酰胺和0. 2gSDS(十二烷基硫酸钠）。
[0061] 为了满足我国当前对瓜类上病原物高通量检测方法的迫切需要，有效控制瓜类上 病原物的发生和促进瓜类进出口贸易的发展，设计了本发明所述的瓜上10种病害的微阵 列芯片检测方法及所用芯片探针。本发明符合检验检疫准确、快速、简便、高通量的技术要 求，从接收样品算起，一次性检测10种病原物，总耗时不超过1天，大大缩短不同病原物的 鉴定过程，这对于有效控制病原物的入侵、蔓延起关键作用，为控制疫病疫情、加快口岸验 放速度赢得宝贵的时间。
[0062] 本发明首次对瓜类植物上的十种病害进行了基因芯片检测技术的探索，从而建立 一种可直接对这十种病害进行准确检测的新方法，同时为基因芯片技术能够更广泛地应用 于其他病害研究打下基础。
【附图说明】
[0063] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0064] 图1为引物荧光标记PCR扩增结果图；
[0065]_h：1.DL2000Marker；2.Cladosporiumcucumerinum-1 ；3.Cladosporium cucumerinum-2 ；4.Cladosporiumcucumerinum-3 ；5.Acidovoraxavenaesubsp. citrulli-1 ；6.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-2 ；7.Acidovoraxavenaesubsp. citrulli-3 ；8.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-4 ；9.Acidovoraxavenae subsp.citrulli-5 ；10.Colletotrichumorbiculare-1 (GAPDH) ；11.Colletotrichum orbiculare-2(GAPDH) ；12.Colletotrichumorbiculare-3(GAPDH) ；13.Colletotrichum orbiculare-4(GAPDH) ；14.Colletotrichumorbiculare-1 (GS) ；15.Colletotrichum orbiculare-2 (GS) ；16.Colletotrichumorbiculare-3 (GS) ；17.Colletotrichum orbiculare-4 (GS) ；18.Didymellabryoniae-1 ；19.Didymellabryoniae-2 ；20.Didymella bryoniae-3?21.Didymellabryoniae-4 ；22.DL2000Marker
[0066] 下：1.DL2000MarkerMonosporascuscannonballus-1 ；3.Monosporascus cannonballus-2 ；4.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-1 ；5.Cucumbergreen mottlemosaicvirus-2 ；6.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-3 ；7.Phomopsis sclerotioides-1 ；8.Phomopsissclerotioides-2 ；10.Squashmosaicvirus-1 ； 11.Squashmosaicvirus-2 ；12.Squashmosaicvirus-3 ； 13.Psendomonassyringae pv.lachrymans-1 ；14.Psendomonassyringaepv.lachrymans-2 ；15.Psendomonas syringaepv.lachrymans-3 ；16.Cucumbermosaicvirus-1 ；17.Cucumbermosaic virus-2 ；18.Cucumbermosaicvirus-3 ；19.DL2000Marker
[0067] 图2为芯片杂交前预扫描结果。