从哺乳动物组织分离的椎间盘细胞、使用方法及其制备方法
【专利说明】从晡乳动物组织分离的椎间盘细胞、使用方法及其制备方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请N0.61/794，691的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
[0003]该公开内容涉及椎间盘细胞的分离以及在退行性椎间盘疾病的治疗中的使用方法。
[0004]发明背景
[0005]哺乳动物的脊椎起着两大基本功能:(I)上半身的负载和(2)保护组成脊柱的神经。脊柱是由联锁的椎骨组成，由椎间盘分隔。这些(椎间)盘充当着减震器，并使脊柱能够弯曲，压缩，和扭曲。椎间盘具有两个基本部分:外纤维结构(纤维环)和凝胶状内部结构(髓核)。在青年哺乳动物体内，健康髓核的80%为水。随着时间流逝，髓核的高含量水丢失，进而丧失吸收冲击的能力。此外，椎间盘可由于脱水、疾病、过度使用、损伤或创伤引起破裂、肿胀、疝等。椎间盘也容易为其他疾病所影响，如椎间盘退行性病变。
[0006]在健康的椎间盘中，细胞只占有总体积的很小部分。大量的椎间盘体积是细胞产生的细胞外基质(ECM ;胶原蛋白和蛋白聚糖，其协助保留了大量的水分)，并且髓核和纤维环的大多数区别在于含水量和ECM的组成。
[0007]椎间盘退行性病变所导致的背部疼痛是导致发病、残疾和丧失劳动力的一个重要原因。背部疼痛常常被认为是限制45岁以下人群活动以及就诊、住院和外科手术的原因。每年，人群中15% -45%会报告慢性背部状况发生，而在其生命的某一段时间，则有人群中70%至85%报告。在医疗健康支出以及丧失的工作时间方面，对于社会财政的影响巨大。在美国，每年需要进行一百多万例脊椎手术。更有甚者，脊柱外科的腰椎节段融市场估计具有超过十亿美元的年收入。
[0008]尽管对于遭受背部疼痛和脊柱疾病的患者的手术和非手术治疗方案都在持续进步，却没有消除或持续改善这种状态的解决方案。目前，脊柱疾病的治疗方法包括类固醇注射，物理疗法，椎间盘切除术和脊柱融合术。多家公司推出了脊椎假体。然而，这些假体在设计上，例如，在轴承表面、骨质固定、关节数量、材料、约束、旋转的移动性上，有很大的不同，且在实践中收效甚微。
[0009]核置换或髓核置换也是可作为治疗退行性盘疾病的选择。在一些情况下，这些设备由聚乙烯套筒包裹水凝胶核心组成其能使该装置在正常装卸过程中的收缩和溶胀。这可以部分地帮助恢复椎间隙高度，并有助于模仿健康人的盘。
[0010]盘置换并非没有并发症。最常见的并发症包括邻近水平的脊椎疾病、沉降和关节面炎症。而且，来源于临床试验的最近研究表明了感染、椎体骨折、植入位置不正、沉降、机械故障和椎旁异位骨化的事件。还报道有更严重的并发症，包括植入物的前脱位。此外，全椎间盘成形术中的磨损粒子产生和对脊髓的潜在影响的问题仍然是未知的。
[0011]目前所需要的是可有助于将对象的椎间盘进行修复或更换椎间盘生物疗法。
[0012]发明概述
[0013]本文公开的是分离的椎间盘细胞群，其使用方法，以及制备方法。所述的椎间盘细胞群被用于修复、重建以及更换损坏、受伤、或患病的椎间盘。在一些实施方式中，椎间盘细胞群衍生自从哺乳动物椎间盘组织，并在体外以非贴壁依赖条件下生长。在一些实施例中，细胞培养基包含含有一种或多种选自下组的添加剂的介质:EGF、bFGF、血清，成纤维细胞调节介质，和粘性非反应性物质。在一些案例中，所述的细胞生长于含有低粘附涂层的容器中。所述的椎间盘细胞群可以在需要的对象中组合用于自体和/或非自体椎间盘治疗。
[0014]所述的椎间盘细胞可使用非可吸收材料或可吸收材料而在体外或体内体内用作生产人工椎间盘替代物。所述的材料可以创建一个人工环来容纳椎间盘细胞群，其可以单独或与以下各项中的至少一种进行组合一一支架材料、基质材料、载体材料、生长因子和/或其它生物活性剂。人造环可以包括连接装置，以便它可以被固定到一个或多个椎体上。例如，所述的人工换可以包括通孔、扣、连接端环、或垫圈，以使其能够螺合固定至一个或多个椎体上。人造椎间盘可手术植入主体，从而完全取代椎间盘。
[0015]本申请公开了各种从自体和非自体供体来来获得并椎间盘源性细胞的方法。本申请公开了一种椎间盘源性细胞群的衍生方法，所述的方法包括:从组织中分离一个或多个细胞；在贴壁依赖中对所述一个或多个细胞进行培养；将所述的一个或多个细胞转移至非贴壁依赖中。本申请还公开了一种方法，通过向所需对象使用治疗量的椎间盘源性细胞群以对所述对象至少一个椎间盘进行治疗，从而治疗所述对象。在各种实施方案中，所述的组织是哺乳动物椎间盘组织，例如，来自于捐赠的器官或脊椎。在一些方面，所公开的方法包括，将所述细胞群在贴壁依赖至少传代一段时间，和所述细胞群产生细胞外基质。在一些方面，所述的细胞群产生一个或多个选自下组的细胞表面标记物:⑶24、⑶34、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、Stro-1、HIFl、巢蛋白、CK8和HLA蛋白，其中表达一个或多个细胞表面标记物的细胞在细胞群中的百分比大于70%或小于40%。在本发明所公开的方法的一些方面中，所述细胞群表达一种或多种选自下组的基因或基因产物:GAPDH、SDHA,HPRTl、B2M、Sox9、聚蛋白多糖、Co 11、Co 12、巢蛋白、CK8、Sox 1、CD44、ALP1、PPARG、ADAMTS、MMP、FMOD、和IL0
[0016]在另一方面，本申请描述了椎间盘源性细胞群，其中大于40%的所述细胞产生细胞表面标记物CD44、CD73、CD90、HLA-A、B或C、CD24、CD105、CD166、或其组合，且小于约20%的细胞群产生⑶34、HLA-DR或-DQ、或STR0-1。在一些实施方案中，约80-100%的细胞群产生⑶73、⑶90、⑶44、HLA ABC、或其组合。在一些实施方案中，约20-75%的细胞群产生CD105、CD166、CD24、或其组合。
[0017]根据一个方面，本发明提供一种治疗至少一个椎间盘患有疾病或损伤的的对象的方法，所述椎间盘的疾病或损伤是由年龄、创伤、毒素暴露、药物暴露、放射暴露、氧化、免疫复合物沉积或移植排斥诱发的。
[0018]根据另一个方面，本发明提供了用于治疗至少一个椎间盘患有疾病或损伤对象的试剂盒，其包含药学上可接受的载体，治疗疾病或损伤有效量的椎间盘源性细胞，脊柱组织，并且其中所述细胞能够在培养基中扩增，并具有分化的潜能。在一些实施例中，所述的试剂盒包括至少一种制剂。
[0019]附图简要说明
[0020]本专利的文件包含至少一张彩色图片/照片。带有彩色图片/照片的本专利文件的副本在请求并支付了必要的费用情况下，将由专利局提供。
[0021]本发明的主题在说明书的结论部分被特别地指出并清楚地要求。然而，所述的发明无论是对于组织和操作方法，以及目的，特征和优点，通过以下详述作为参考，当与附图一同阅读时，用于对本发明进行最好的理解，其中:
[0022]图1示出的已知的，用于确定干细胞和成软骨细胞的各种表面标记物表达谱。检测了八种细胞类型:成纤维细胞，软骨细胞，间充质干细胞(MSCs)，单层培养椎间盘细胞(贴壁)，以及悬浮培养的椎间盘细胞(非贴壁)。
[0023]图2显示了在悬浮培养基中生长的椎间盘源性细胞的细胞形态。
[0024]图3显示了椎间盘源性细胞与MSC的软骨分化潜能对比。
[0025]图4显示了椎间盘源性细胞的成脂和成骨潜能。
[0026]图5显示了在与粘性I %透明质酸支架组合，然后通过27G1.5英寸手术针挤出后细胞的存活率(绿色，或在黑/白中显亮色-活，红色或黑/白中显暗色-死)。
[0027]图6示出用于治疗用途的椎间盘源性细胞用以治疗各种形式的椎间盘疾病的潜在的设备和制剂。治疗可以通过注射(顶部)或植入(底部)。细胞和载体/支架可以是在一起的，或在使用前即刻混合。
[0028]图7显示了椎间盘源性细胞与粘稠支架载体形成的制剂修复兔椎间盘退行性变(动物模型)的体内功效。
[0029]图8为表示椎间盘细胞的制备和植入的示意性流程图。步骤a显示了椎间盘的示意图。步骤b显示了从脊柱新鲜分离的人椎间盘。步骤c示出解剖和酶消化之后的髓核细胞。贴壁的细胞在EGF和FGF-2的存在下进行扩增。比例尺=50 μ m。步骤d是转移至含有甲基纤维素的接触抑制培养环境中的细胞纤维照片，其中，细胞簇和细胞球培养了约2个星期。比例尺= 200 μπι。步骤e是用于注射已洗去含有甲基纤维素的培养基并与未交联的透明质酸支架相结合的细胞的注射器。步骤f示出了在兔退行性变椎间盘中的用于注射细胞和支架混合物的注射器，在此之后，进行了为期约I个月的安全性和有效性评估。
[0030]图9A-F显不了用于生广聚蛋白多糖和Jj父原蛋白的椎间盘细胞。图9A是苏木精和伊红染色的相位图像。图9B是阿尔辛蓝与核固红的对比染色相位图像。注意单细胞周围基质的存在(左)。比例尺=10微米。图9C是天狼猩红染色相位图像。图9D是一个共焦图象，包括肌动蛋白(红色)和细胞核(蓝色)。图9E是聚集蛋白聚糖，胶原蛋白和肌动蛋白(无核)的共焦图像，附带有放大图，其中黑色箭头表示细胞内聚集蛋白聚糖，而白色箭头表示细胞外聚集蛋白聚糖。图9F是条形图，显示了随时间流逝，基质分子(聚集蛋白聚糖和胶原蛋白2A)在培养基内第14天的收获和软骨细胞分化后的RT-PCR分析。通过对管家基因HRPT的归一化交叉阈值，以及第O天的基线基因表达，对表达倍数进行了计算。
[0031]图10A-C描绘了对于椎间盘源性细胞的流式细胞仪研究。图1OA是前向和侧向散点图，显示了应用于所有后续分析的限制，包括89%的细胞群。图1OB是表示5个不同人供体的椎间盘细胞的表达水平的柱状图，(相对于同种型对照)。图1OC示出表面标记物表达的代表性直方图。
[0032]图1lA-E显示了椎间盘细胞的多能性。图1lA显示了通过茜素红染色显示的成骨分化。图1lB显示了通过油红O染色显示的成脂分化。图1lC显示了微团形成后的成软骨细胞分化(阿尔辛蓝和核固红)。比例尺=100微米。图1lD是条形图，显示在软骨形成细胞分化为软骨细胞(AC)、成人成纤维细胞(FB)、骨髓来源的MSC、和椎间盘源性细胞(DC)之后，可溶性(介质)和不溶性(微团)GAG生产的定量评估。图1lE为显示了产生GAG总量归一化到各种细胞类型的DNA含量的条形图。直线表示显著差异(p〈0.01，单因素方差分析和Bonferroni的事后检验)。
[0033]图12A-显示在兔盘退行性变模型中处理的安全性和有效性评估。图12A是代表性的X射线，每2周进行，并用来在如图所示的18骨个骨性标记基础上计算椎间盘高度指数(DHI)。图12B显示了兔子体重(治疗注射第14天)的研究期间保持在正常范围内。图12C是DHI在6周的治疗中的曲线图，显示了相比对照组的情况，治疗在4周和6周后改善了 DHI，且低剂量比高剂量的表现更好。没有观察到支架或损伤对照组的改善，而未损伤对照组的盘高度与第O周持平。
[0034]图13A-B显示了治疗6周初步研究(Pilot Study)后的组织学评价。图13A是健康、损伤、和处理过的椎间盘横截面(苏木精和伊红染色，比例尺=2mm。图13B示出处理后的IVD各种区域，包括骨髓、纤维环(AF)，软骨终板(CEP)，和髓核(NP)经苏木精和伊红(H&E)，或阿尔辛蓝染色后的组织学表现伊红(比例尺=10um)。
[0035]图14A-C显示对猪进行初步治疗的安全性和有效性(12周)。图14A是显示了相比损伤对照组，在12周内以持续方式改善DHI (p〈0.05)的IDCT剂量曲线图；在支架或损伤对照组中没有发现有改进，而未损伤对照组的椎间盘高度与第O周持平。图14B是处理过程中猪脊椎的荧光镜图(注意在损伤盘中塌陷的椎间盘空间)。图14C显示了 IDCT治疗的椎间盘组织学评价，包括髓核(NP)、软骨终板(CEP)和纤维环(AF)，由苏木精和伊红(H&E)，或阿尔辛蓝染色。
[0036]发明详述
[0037]所述的椎间盘源性细胞是衍生自椎间盘组织的细胞，其可用于椎间盘的治疗和/或修复。在某些情况下，椎间盘源性细胞可以在体外进行处理，以提供比其它细胞在修复、更换、或增加现有的或损坏的髓核组织更有效的椎间盘源性细胞。在许多实施例中，椎间盘源性细胞产生胞外基质。在一些实施例中，椎间盘源性细胞产生蛋白聚糖。在一些实施例中，椎间盘源性细胞产生胶原蛋白。在其他实施方式中，椎间盘源性细胞植入相邻的天然细胞可有助于通过化学、机械或其它动因刺激天然细胞。例如，椎间盘细胞可分泌生长因子，细胞因子或其它蛋白质。
[0038]如本文所用，“椎间盘源性”是指能够在体内产生椎间盘组织的能力。在一些实施方式中，椎间盘源性细胞能够在体内使患病的或受损和/或丧失了椎间盘组织一种或多种性能的椎间盘组织得以重建。在一些情况下，“椎间盘源性”细胞可以在体外产生椎间盘组织，例如，椎间盘源性细胞可被用于生成用于植入的人造椎间盘。
[0039]如本文所用，当“维持”指在体外生长的细胞时，是指包括在培养基中生长了大于24小时的细胞。在一些情况下，维持细胞被划分在细胞培养物内。
[0040]“微团(Micromass) ”是在抑制贴壁的圆锥形容器中，由约10，000至1，000, 000细胞聚集形成的，这导致细胞形成至少一个单一团。所述的微团可另外含有细胞外基质。它基于一个用于确定成软骨潜力的检测，并且也被称为细胞团(pellet)。
[0041]当“约”用于本文中指可测量的值(例如一个量，时间持续时间等)时，是指小于约±20%的变化。在一些情况下，“约”指10%的变化或更小，或±5%的变化或更小。在一些情况下“约”可以指±1% -±0.