个性化的高纯度肝细胞癌干细胞、所述干细胞的方法和用图
【专利说明】个性化的高纯度肝细胞癌干细胞、所述干细胞的方法和用 途
[0001] 相关申请的夺叉参考 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月7日提交的美国临时专利申请 61/774,517的权益。本申请也是2013年8月6日提交的国际申请PCT/US2013/053850的 部分继续申请，所述国际申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2012年8月15日提交的美国 临时专利申请61/683, 477和2012年10月25日提交的美国临时专利申请61/718, 643的 权益。所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及肝细胞癌干细胞、源自所述干细胞的免疫原性组合物以及制造和使用 所述干细胞的方法。
【背景技术】
[0003] 在实体肿瘤中，较小百分比的细胞具有作为亲本肿瘤引发具有相同组织学异质性 的肿瘤的能力。这些细胞被称为癌症干细胞，并且也被称为肿瘤起始细胞或癌症起始细胞。 癌症干细胞可以由一组特性来定义。首先，其具有使自身再生的能力。第二，其在移植时能 够建立新肿瘤。第三，其可以被表征为休眠或缓慢循环(细胞周期)的肿瘤细胞。第四，其可 能是造成肿瘤对化学疗法或放射疗法的抵抗性的原因。第五，其取决于维持其再生并且产 生更分化祖细胞的能力的特定微环境，其中所述环境维持癌症干细胞的未分化状态。这种 微环境可以包括间充质细胞干细胞、组织相关联的成纤维细胞以及内皮细胞。在体外培养 的情况下形成球状体的能力是可以有助于将特定细胞识别为癌症干细胞的又一个特征。癌 症干细胞的一个非限制性定义是能够再生亲本肿瘤的完整异质性并且即使在多次传代之 后也连续地生长的细胞。
[0004] 特定癌症干细胞群体可能是赘瘤来源，并且可能是已经治疗的癌症复发的来源。 另外，癌症干细胞在组织中的亚群当暴露于某些信号中时可能重新启动生长周期并且产生 可以重建肿瘤的细胞。癌症干细胞的小环境是休眠的，直到正确的信号传导触发再进入增 殖周期。再进入信号可以来源于局部事件，如外伤、细胞损伤、微生物攻击(病毒、细菌或真 菌)，或由局部生长因子、细胞因子或细胞间通信来介导。另外，激素可以调节组织特异性小 环境中的干细胞。干细胞小环境的缺陷或突变可能导致上文功能的扰动。赘瘤可能由这类 扰动产生，并且这些扰动包括影响对细胞周期的控制的随机突变。导致癌症的突变在个体 之间变化。在患有一种类型的癌症的那些人之间（如一个乳腺癌患者对比另一个乳腺癌患 者）以及在不同类型的癌症之间（如肝癌对比黑色素瘤）观察到这类变化性。
[0005] 针对癌症发展出的疗法包括涉及自体免疫反应的方法。这些方法包括使用新鲜采 集的自体肿瘤细胞，所述自体肿瘤细胞解聚并调配成疫苗载体。另一种方法是树突状细胞 疫苗，其中树突状细胞用自体肿瘤裂解物脉冲。又一种方法是用半乳糖聚合物对患者的肿 瘤细胞进行体外修饰，并且将经修饰的肿瘤细胞注射回到所述患者中，其中半乳糖标记的 肿瘤细胞更容易由抗原呈递细胞（APC)吸收，由此增加抗肿瘤反应。这些涉及自体免疫疗法 的方法中的缺点是当使用块状肿瘤或块状肿瘤抗原作为免疫刺激剂时的低的抗原信噪比。 大部分肿瘤细胞是相当分化的并且与正常细胞如血管成分、结缔组织、分化的肿瘤细胞、非 活细胞和坏死细胞以及正常宿主组织混合。癌症干细胞仅代表肿瘤块的较小部分，在更具 攻击性的肿瘤中有时最多4%，最常见小于1%。因此，当使用块状肿瘤作为抗原来源时，免疫 反应是针对更分化的细胞，从而允许干细胞逃避攻击并且可能造成肿瘤的复发或转移。
[0006] 另一种新疗法是针对在癌症中更丰富地表达的正常抗原的单一靶向抗体。特异性 抗原靶向疗法(如抗⑶133、抗EpCAM、抗⑶44、抗⑶13等）是无辨别力的，并且影响正常细 胞以及癌细胞，从而引起对患者的巨大不良作用。
【发明内容】
[0007] 本文公开肝细胞癌（HCC)癌症干细胞（CSC)、HCC_CSC细胞系以及用于治疗肝细胞 癌的包含HCC-CSC负载型树突状细胞的免疫原性组合物。
[0008] 特别地，本文提供一种用于制备肝细胞癌（HCC)癌症干细胞（CSC)的群体的方法， 所述方法包含：获取HCC样本；使所述样本的细胞解离，以及在非粘附性底物上在成分确定 的培养基中体外培养所述解离的细胞，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有 至少一种经由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)路径起作用的生长因子，由此形成HCC-CSC球 状体；其中所述HCC-CSC球状体群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更 多个：α胎蛋白（AFP)、EpCAM、0vl以及0V6。在另一个实施方案中，所述HCC-CSC球状体群 体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CK7、CK19以及E-钙粘 素。在另一个实施方案中，所述HCC-CSC球状体群体中至少约90%的细胞表达以下生物标 记中的两个或更多个：AFP、EpCAM、Ovl以及0V6。
[0009] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养 基中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有至少 一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成早期HCC-CSC的群体，其中所述早 期HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：Nanog、Sox2、 0ct3/4以及c-kit。在另一个实施方案中，所述早期HCC-CSC群体中至少约80%的细胞进一 步表达以下生物标记中的一个或多个：EpCAM、E-钙粘素、Sox 7、Sox 17、Fox2A、0vl、0V6、 ⑶133以及⑶90。在另一个实施方案中，所述早期HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达 以下生物标记中的两个或更多个：Nanog、Sox2、0ct3/4以及c-kit。
[0010] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清并且补充有至少一种经 由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成混合HCC-CSC的群体，其中所述混合HCC-CSC 群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：AFP、CK7、CK19、EpCAM、 E-钙粘素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。在另一个实施方案中，所述混合HCC-CSC群体 中至少约90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：六??、〇(7、〇(193?041^-钙粘 素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。
[0011] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培 养基中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清来源并且补充 有至少一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成胚胎向间充质细胞转变的 (EMT)-HCC-CSC的群体，其中所述EMT-HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记 中的两个或更多个：NCAM、Slug/Snail以及Twist。在另一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC 群体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：AFP、N-钙粘素、⑶44 以及波形蛋白。在又一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达以 下生物标记中的一个或多个：NCAM、Slug/Snail以及Twist。
[0012] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述HCC-CSC球状体、所述混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC，其中所述成分确定的培养 基是无血清的并且补充有至少一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成早期 HCC-CSC的群体，其中所述早期HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两 个或更多个：似11(^、3(?2、0(^3/4以及(3-1^^。在另一个实施方案中，所述早期!1〇：-03(：群 体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CK7、CK19以及E-钙粘 素。在又一个实施方案中，所述早期HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达以下生物标记 中的一个或多个：Nanog、Sox2、0ct3/4 以及c-kit〇
[0013] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述HCC-CSC球状体、所述早期HCC-CSC或EMT-HCC-CSC，其中所述成分确定的培养 基含有血清来源并且补充有至少一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成混 合HCC-CSC的群体，其中所述混合HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中 的两个或更多个：4??、〇(7、〇(193口041^-钙粘素、似11(^、？(《42!1即43以及48062。在另 一个实施方案中，所述混合HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达以下生物标记中的两个 或更多个：AFP、CK7、CK19、EpCAM、E-钙粘素、Nanog、FoxA2 HNF4a以及ABCG2。
[0014] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述HCC-CSC球状体、所述早期HCC-CSC或混合HCC-CSC，其中所述成分确定的培 养基含有血清来源并且补充有至少一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成 EMT-HCC-CSC的群体，其中所述EMT-HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中 的两个或更多个：NCAM、Slug/Snail以及Twist。在另一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC 群体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：AFP、N-钙粘素、⑶44 以及波形蛋白。在又一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达以 下生物标记中的一个或多个：NCAM、Slug/Snail以及Twist。
[0015] 在一个实施方案中，所述成分确定的培养基是表2中所描述的任何培养基；来自 于表2和表3的组合的任何培养基；来自于表2、表3和表4的组合的任何培养基；或来自 于表2和表4的组合的任何培养基。
[0016] 在一个实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子（FGF)、表皮生长因子 (EGF)或活化素A中的一个或多个。在另一个实施方案中，所述FGF是碱性FGF(bFGF)。在 又一个实施方案中，所述成分确定的培养基并未补充有活化素A。在另一个实施方案中，所 述成分确定的培养基以有效防止HCC干细胞自发分化的量补充有活化素A的激动剂。在又 一个实施方案中，所述活化素A拮抗剂是卵泡抑素或与活化素A特异性结合的抗体。
[0017] 在另一个实施方案中，所述培养基并未补充有抗氧化剂。在另一个实施方案中，所 述抗氧化剂是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、腐胺或β-巯基乙醇。在又一个实 施方案中，所述成分确定的培养基补充有谷胱甘肽。
[0018] 在另一个实施方案中，所述粘附性底物经配置以与锚着依赖性细胞(如成纤维细 胞）粘附，并且收集所述细胞。在另一个实施方案中，所述非粘附性底物是超低粘附性聚苯 乙烯表面。在又一个实施方案中，所述粘附性底物包含涂布有富含RGD三肽基序的蛋白质 的表面。
[0019] 本文还提供一种经纯化的HCC-CSC细胞的群体，其通过本文所公开的方法中的 任一种来制备。在某一实施方案中，所述经纯化的HCC-CSC细胞是HCC-CSC球状体、早期 HCC-CSC、混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC。
[0020] 本文还提供一种HCC-CSC细胞系，其通过本文所公开的方法中的任一种方法来制 备。在某一实施方案中，所述经纯化的HCC-CSC细胞是HCC-CSC球状体、早期HCC-CSC、混合 HCC-CSC或EMT-HCC-CSC。
[0021] 在一个实施方案中，本文提供一种免疫原性组合物，其包含由源自本文所公开的 经纯化HCC-CSC细胞群体或HCC-CSC细胞系的肿瘤抗原离体活化的树突状细胞。在另一个 实施方案中，所述肿瘤抗原包含所述经纯化HCC-CSC细胞或所述HCC-CSC细胞系的细胞提 取物。在另一个实施方案中，所述肿瘤抗原包含所述经纯化HCC-CSC细胞或所述HCC-CSC 细胞系的裂解物。在另一个实施方案中，所述肿瘤抗原包含完整的经纯化HCC-CSC细胞或 来自所述HCC-CSC细胞系的完整细胞。
[0022] 在另一个实施方案中，所述完整HCC-CSC细胞被赋予非增殖性。在另一个实施方 案中，所述完整细胞通过辐射而被赋予非增殖性。在又一个实施方案中，所述完整细胞通过 将所述细胞暴露于核交联剂中而被赋予非增殖性。
[0023] 在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的载体和/ 或赋形剂。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。在另一个实施方 案中，所述佐剂是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
[0024] 在又一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含树突状细胞和HCC-CSC细胞。在 另一个实施方案中，所述经纯化的HCC-CSC细胞或所述HCC-CSC细胞系呈HCC-CSC球状体、 早期HCC-CSC、混合HCC-CSC或EMT-HCC-CSC形式。
[0025] 还提供一种在有需要的受试者中治疗肝细胞癌的方法，其包含向所述受试者给予 本文所公开的免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物以多个剂量形式 给予，每一个剂量包含约5-20X106个细胞。在另一个实施方案中，所述剂量包含约10X 1〇6个细胞。在另一个实施方案中，所述剂量每周给予一次，持续2-5个剂量，接着每月给予 一次，持续3-6个剂量。在又一个实施方案中，所述受试者接受6-10个剂量的免疫原性组 合物。
[0026] 还提供一种在有需要的受试者中刺激针对肝细胞癌的免疫反应的方法，其包含向 所述受试者给予本文所公开的免疫原性组合物、本文所公开的HCC-CSC或本文所公开的 HCC-CSC细胞系。
[0027] 还提供本文所公开的免疫原性组合物、本文所公开的HCC-CSC或本文所公开的 HCC-CSC细胞系在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途。
[0028] 还提供本文所公开的免疫原性组合物、本文所公开的HCC-CSC或本文所公开的 HCC-CSC细胞系用于治疗肝细胞癌的用途。
【附图说明】
[0029] 图1是从切除的肿瘤中（实线方框和箭头）或从如针活检的小样本(虚线方框和箭 头）中将肝细胞癌（HCC)干细胞（HCC-CSC)分离、扩增以及采集成球状体的过程的流程图。 在生成球状体之后，产生HCC-CSC亚群的路径是常见路径。
[0030] 图2是球状体的示意图。
[0031] 图3A和3B描绘各种形状和大小的球状体。
[0032] 图4描绘处于扩增期的HCC干细胞。
[0033]图5描绘附接到超低粘附性底物上的细胞。
[0034] 图6描绘对活化素A不敏感的HCC干细胞。这些细胞以紧密集落生长，并且由正 常宿主组织(成纤维细胞）环绕。更分化的肿瘤细胞通过活化素A的存在来消除。
[0035] 图7描绘通过暴露于活化素A中而选择的以对干细胞具有特异性的紧密集落生长 的HCC干细胞。
[0036]图8描绘用含有小的自身再生细胞的胚胎干细胞样集落的富集HCC培养物。
[0037]图9描绘在接种在粘附性底物上之后七天时，由来自HCC肿瘤的针活检的酶促解 离而产生的细胞(相衬10X)。
[0038] 图10描绘在图9的细胞生长14-21天之后的典型密集集落形成_衬10X)。
[0039] 图11描绘在多次传代之后建立的高增殖性HCC干细胞系_衬10X)。
[0040] 图12A描绘用核复染(双苯甲亚胺)对α胎蛋白（AFP)呈染色阳性的HCC细胞系， 证实HCC身份(落射荧光，20Χ)。图12Β描绘在用于AFP染色的红色通道图像中的图12Α 细胞。图12C描绘用于双苯甲亚胺的蓝色通道图像。
[0041] 图13Α描绘具有高百分比神经细胞粘附分子（NCAM)染色的细胞，证实在确立的培 养物中的早期癌症祖细胞表型选择(包括核复染，双苯甲亚胺)(落射荧光，40Χ)。图13Β描 绘在用于NCAM染色的红色通道图像中的图13Α细胞。图13C描绘用于双苯甲亚胺的蓝色 通道图像。
[0042] 图14Α描绘针对⑶44标记为阳性的HCC细胞系，所述⑶44是对具有高转移潜力 的癌症干细胞具有特异性的侵袭力标记。细胞也用核复染，双苯甲亚胺染色(落射荧光， 40Χ)。图14Β描绘在用于⑶44染色的绿色通道图像中的图14Α细胞。图13C描绘用于双 苯甲亚胺的蓝色通道图像。
[0043] 图15Α描绘使用双苯甲亚胺核复染的EMT-HCC-CSC细胞系中上皮细胞向间充质细 胞转变标记波形蛋白和Slug/Snail。图15Β描绘在用于Slug/Snail染色的红色通道图像 中的图15A细胞。图15C描绘在用于波形蛋白的绿色通道图像中的图15A细胞。图15D描 绘用于双苯甲亚胺的蓝色通道图像。
【具体实施方式】
[0044] 本发明提供一种从人