Trpm8蛋白和相关多肽片段及其抗体的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫诊断试剂领域以及治疗药物领域，具体涉及一种TRPM8蛋白、相 关多肽片段或其抗体在慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征诊断中的应用以及针对该蛋 白的单克隆或多克隆抗体在治疗慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征中的应用。
【背景技术】
[0002] 前列腺炎是成年男性的常见疾病。我国前列腺炎症状的男性人群发生率为8. 4%， 就诊患者占泌尿外科门诊患者总量的的8~25%。有资料显示约有50%的男性在一生中 的某个时期会受到前列腺炎的影响。
[0003] 前列腺炎目前分为四种类型，其中III型，即：慢性前列腺炎（III a型）/慢性骨盆疼 痛综合征（Illb 型）（chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes,慢性前列 腺炎或慢性骨盆疼痛综合征），相当于传统分类方法中的cnp和ro，是前列腺炎中最常见的 类型，约占慢性前列腺炎的90%以上。主要表现为长期、反复的骨盆区域疼痛或不适，持续 时间超过3个月，可伴有不同程度的排尿症状和性功能障碍，严重影响患者的生活质量。同 时，其庞大的患者人群和高昂的医疗费用给公共卫生事业造成了较大的经济负担。
[0004] 由于目前对慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征的病因、发病机制至今未能明 确，病理生理学改变还不十分清楚，对前列腺炎的确诊、病情轻重的判断、治疗方法的选择 以及疗效评价等诸多方面，国内外均无明确的标准可依，所以目前绝大多数临床医师在临 床诊治前列腺炎过程中感到比较困难。
[0005] 2001年，Tsavaler等用人类前列腺特异性互补DNA文库的方法鉴别出了一种新 型基因。这种基因编码分子量约为130ku的蛋白，与TRP通道蛋白有高度同源性，被命名为 TRPM8。人类编码TRPM8的基因位于染色体部位2q37. 1，全长102. 12kb，由25个外显子构 成。它编码的mRNA可以翻译为含有1104个氨基酸的蛋白质。对已公布的基因组序列的分 析说明TRPM8在所有被研究的恒温脊椎动物中均有表达。Julius等发现TRPM8是一种冷激 活的温度觉TRP通道。Tsavaler等在一些原发肿瘤如乳腺、结肠、肺和皮肤来源的肿瘤中也 有表达。随后的研究发现TRPM8 mRNA或蛋白还存在与背根神经节和三叉神经的感觉神经 元，以及肠系膜迷走神经节，胃底、血管平滑肌、肝脏、膀胱上皮和男性生殖系统中。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了 TRPM8蛋白及抗体在制备慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊 断试剂与治疗药物中的应用，运用"单克隆抗体"技术原理研制的抗TRPM8抗体酶联免疫诊 断试剂盒或荧光免疫层析法/均相免疫荧光法诊断试剂，能快速、特异性的诊断出患者所 患的疾病是否为慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征并评估出病情的进展情况或治疗效 果，使慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者得到及时的治疗，有效提高患者的生活质 量；或者通过给慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综合征患者以抗TRPM8抗体来治疗该疾病。
[0007] 本发明具体技术方案如下： 一种TRPM8相关多肽片段，其特征在于氨基酸序列片段如SEQ ID N〇:l-6所示。
[0008] 本发明所述的TRPM8相关多肽片段选自TRPM8蛋白全部氨基酸序列中的不 同长度多肽片段，以人源的TRPM8蛋白为例，例如：1025-1104段选择如下序列：TRPM8 -1:KINTKANDTSEEMRHRFRQLDTKLND(SEQ ID:No 1), TRPM8-2:FKNEDNETLAWEGVMKENYL(S EQ ID:No 2)，或者在 916-953 段选择如下序列：TRPM8-3:DGTTYDFAHCTFTGNESKPL(SE Q ID:No 3)，或者在 1-692 段选择如下序列：TRPM8-4:VSRNLGPKHMLQ(SEQ ID:No 4)， TRPM8-5:DEVRQWYVNGVNYFTD(SEQ ID:No 5), TRPM8-6:LTVIKMEEAGDEIVSNA(SEQ ID:No 6)〇
[0009] 本发明还公开了 TRPM8蛋白、TRPM8相关多肽片段及其相应抗体在制备慢性前列 腺炎或慢性骨盆疼痛综合征诊断试剂中的应用。
[0010] 本发明所述TRPM8蛋白可选自任意动物来源的TRPM8蛋白，优选哺乳动物来源，更 优选人源。以人源或鼠源为例，其信息如表1所示：
本发明所述的应用，所述诊断试剂可以但不限于免疫诊断试剂、生化诊断试剂、荧光免 疫层析法诊断试剂或者均相免疫荧光法诊断试剂。
[0011] 本发明所述的应用的一种优选方案为通过免疫学方法利用TRPM8蛋白、TRPM8相 关多肽片段，检测生物体，例如人，包括但不限于血清、血浆、前列腺液等体液中的TRPM8蛋 白分子或TRPM8相关多肽片段的抗体，或者利用由任何种属动物制备的或基因工程方法合 成的TRPM8蛋白或TRPM8相关多肽片段的多克隆或单克隆抗体检测人包括但不限于血清、 血浆、前列腺液等体液中的TRPM8蛋白分子或TRPM8相关多肽片段的水平。
[0012] 上述免疫学方法包括但不限于括酶免疫分析（包括非均相酶免疫测定方法、均相 酶免疫测定方法），利用荧光免疫测定方法、电化学发光免疫测定方法或化学发光免疫方法 进行测定的发光免疫分析（包括酶促化学发光、非酶促化学发光），放射免疫分仪析（包括 放射免疫分析方法、免疫放射分析或免疫放射度量分析方法），免疫浊度分析（包括免疫透 射比浊法、免疫散射比浊法），时间分辨荧光免疫分析等技术方法。
[0013] 以ELISA方法为例，具体方法为：用纯化的人TRPM8蛋白或者TRPM8相关多肽片段 通过包被缓冲液稀释后包被在酶标版上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与 待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物 酶标记的抗人IgG抗体的酶标试剂，形成TRPM8-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗 涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液，所述酶底物溶液在辣 根过氧化物酶催化下变色，并在酸作用下转化为最终的颜色，利用颜色深浅来检测样品中 TRPM8蛋白抗体的水平。
[0014] 或者，用纯化的抗人IgG抗体通过包被缓冲液稀释后包被在酶标版上的微孔内制 成固相抗体，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗体 测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的人TRPM8蛋白抗体或者TRPM8相关多肽片 段抗体的酶标试剂，形成TRPM8-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶 液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液，所述酶底物溶液在辣根过氧化物酶催 化下变色，并在酸作用下转化为最终的颜色，利用颜色深浅来检测样品中TRPM8蛋白的水 平。
[0015] 以免疫均相法为例，具体方法为：在支撑板上依次贴上NC膜、吸水垫、喷涂有荧光 标记抗体的结合垫及已于展开剂中浸润并烘干的玻璃纤维，组装好免疫层析试纸条。在三 维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，均匀平行地将TRPM8蛋白或TRPM8蛋白相关多肽片 段作为包被抗原（T线）和羊抗人或鼠 IgG (C线）在NC膜上喷洒成粗细适中的2条线。置 于37°C控温箱烘干lh后取出，切条机切成4_±2_等宽试纸条，与干燥剂一起装入铝箱 袋中密封保存。然后取待检品滴加于试纸条样品垫适宜位置，层析后在特征激发（320nm)、 发射（620nm)波长下拍照检测。按照上述方法分别进行灵敏度、特异性及模拟阳性样品检 测。当待检品沿试纸条通过毛细作用从下向上虹吸时，根据层析原理，在层析移动过程中， 经试纸条检测端，向另一端移动，先后依次经过结合垫、NC膜上T线和C线到达吸水垫。层 析后，若C线不显色，则试纸条视为无效；若C线显色，则试纸条视为有效。若C线显色而T 线不显色，则测试结果为阳性；若C、T线均显色，则测试结果为阴性。
[0016] 以通过荧光法检测进行的酶免疫均相法为例，具体方法为：将0. 1ml的标准液或 血清与0. 01ml抗体试剂或空白抗体试剂于30°C孵育30min。然后加入酶试剂（0. 04ml)， 混合物于30°C孵育15min。最后加入0. 45ml底物，于30°C孵育lh后，加入13g/L十二烧 基硫酸钠0.05ml中止反应，用荧光法测定形成的NADPH。
[0017] 本发明公开了慢性前列腺炎或慢性骨盆疼痛综