一种人抗凝血酶iii的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物制药领域，涉及一种血制品的制备方法，具体涉及一种人抗凝血酶 III的制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗凝血酶III (antithrombin III，AT- III)是一种维生素 K依赖的单链糖蛋白，在肝 脏、血管内皮细胞和巨核细胞内合成，是凝血酶及因子ΧΠ α、ΧΙ α、ΙΧ α、Χ α等含丝氨酸 的蛋白酶的抑制剂，分子质量为58-64 KD，等电点为4. 8;半衰期约70小时，血浆中含量 260- 320mg/L ;含4个Ν糖基化寡糖链及3个二硫键，由9个α -螺旋结构，3个β -折叠 和1个反应中心环组成；41'-111与凝血酶、？乂&、？乂11&、乂1 &、^&、纤溶酶等丝氨酸以1:1的 比例形成复合物，从而使这些酶失去活性，肝素可加速这一反应达千倍以上，肝素与AT- III 所含的赖氨酸结合后引起AT- III构象改变，使AT- III所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝 氨酸残基结合，一旦肝素-AT- III凝血酶复合物形成，肝素就从复合物上解离，再次与另一 分子AT -III结合而被反复利用。
[0003] AT- III是组成抗凝血的主要成分，占人体总抗凝血能力的75%，是血浆中抑制凝 血酶的关键物质，作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤 维蛋白的溶解，参与保持体内抗凝血功能和纤溶系统与凝血系统的动态平衡，并起着抗凝 调节作用。临床上，血液中AT-III的水平随各种疾病、症状而变化，在弥散性血管内凝血 (DIC)、肝疾患、肾病综合症等降低。血液中的AT- III水平降低可能会导致肝素治疗效果无 法呈现。因此，掌握AT- III的活性作为对于此类疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素 治疗或使用AT- III浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。
[0004] 近年发现AT-III促内皮细胞分泌前列腺环素、抑制白细胞表面趋化受体 syndecan-4,缓解炎症反应。测定血楽;中AT- III含量能够判断血栓形成的病因，可直接抑制 凝血酶也可与凝血酶形成复合物抑制多种凝血因子活性。此外，AT-III对血小板聚集也有 一定抑制作用，是主要的内源性凝血抑制物。作为临床用药，它在治疗先天及后天获得性 AT-III缺乏缺乏症方面，具有难以替代的作用。遗传性AT-III缺乏是一种常染色体显性遗传 性疾病，本病患病率约1/5000,发病多在10-25岁，患者常在手术后、创伤后、感染后、妊娠 或产后发生静脉血栓，并可反复发生血栓。患者血浆中AT- III生物活性与抗原性约为正常 人50%左右，AT-III结构与功能异常的类型较多，共同表现是对肝素的亲和力降低，从而对 丝氨酸蛋白酶的灭活能力明显减弱。获得性AT- III缺乏表现为AT- III合成降低，见于肝脏 疾病、肝功能障碍，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期，常与疾病严重度相关，可伴发血 栓形成。
[0005] 国际上从上世纪60年代开始即开展了从人体血液中制备AT-ΠΙ的研究，随着对 AT-ΠΙ结构及作用机理研究的不断深入，制备方法也日趋成熟，国际上AT-ΠΙ制品已广 泛用于临床，而且已经研制出重组人AT-ΠΙ产品。国内对AT-ΠΙ的研究不多，目前尚无 AT-ΠΙ产品面世，对于因 AT-ΠΙ缺乏导致的各种疾病，缺乏针对性的治疗措施；近年有零 星的研究报道出现，如专利CN103059129A。常规的制备工艺，得率较低，且由于缺少维生 素 k依赖的凝血因子的去除措施，在制备过程容易导致蛋白激活，导致AT-ΠΙ生产合格率 不尚。
[0006] 鉴于此，本发明开发了一种制备AT-ΠΙ冻干粉的新方法，具有工艺稳定、合格率 高，冻干粉复溶液澄清透明，无析出无乳光的优点，且经S/D、纳米膜过滤、干热三步病毒灭 活，大大提高了产品使用的安全性。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺先进，操作方便，质量稳定，产品临床 使用安全、可工业化的人抗凝血酶III的制备方法。
[0008] -种人抗凝血酶III的制备方法，包括如下步骤： (1) 血浆组分IV沉淀溶解 按1 :10-20的比例，将组分IV沉淀投入溶解缓冲液中，温度控制在10-30°C，搅拌2-6 小时，使其充分溶解，得到均匀悬浮液； (2) 聚乙二醇（PEG)沉淀去杂蛋白 在步骤（1)所述的悬浮液中加入40-50% (w/w)的聚乙二醇，搅拌0. 5-1. 5小时，然后 用颇尔公司生产的Supradur 50P滤板串联0. 45Mm滤芯过滤，收集澄清滤液，过滤前用溶解 缓冲液预洗滤板及滤芯； (3) DEAE Sephadex A-50 凝胶吸附 在步骤（2)所收集的滤液中加入DEAE Sephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为 0. 5-1. Og/kg，干凝胶预先用70°C以上的热注射用水溶胀并用25°C以下的冷注射用水冷 却，再用平衡缓冲液平衡；缓慢搅拌〇. 5-1. 5小时，后静置5-15分钟；过滤，收集滤液；凝胶 经洗脱再生后重复使用； (4) S/D病毒灭活 步骤（3)所收集滤液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0· 3% (wt%)，搅匀后升温至24-26Γ，后保温6-7小时，然后用0. 45μπι滤芯澄清过滤； (5) 肝素亲和柱层析 S/D后的滤液上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液充分平衡，上柱结束后先用平衡 缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液洗涤柱子，再用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液，用 0. 45Mm或0. 22Mm滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯AT-ΠΙ溶液； (6) 超滤浓缩 用5K~10K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-6倍，再浓缩至AT-ΠΙ效价高于 40IU/ml ;后移出超滤膜包并后洗膜包，收集浓缩液； (7) 加稳定剂及调节 在步骤（6)所收集的浓缩液中加入稳定剂，调节AT-ΠΙ效价至所需值(一般规格为 30-40IU/ml )，后调 PH 值至 6. 50-7. 50 ; (8) 纳米膜除病毒过滤 用0. lMm滤芯串联20纳米滤芯进彳丁除病毒过滤； (9) 除菌过滤并分装 用0. 22Mffl滤芯对产品进行除菌过滤并分装； (10) 冻干； (11) 干热灭活病毒 将步骤（10)得到的冻干制剂在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。
[0009] 步骤（1)所述的溶解缓冲液组成为0· 01M-0. 02M TRIS，(λ 1Μ-(λ 15M氯化钠，所述 的溶解缓冲液的ΡΗ值为7. 00-9. 50。
[0010] 步骤（2)所述的聚乙二醇的分子量为2000-6000,所述的聚乙二醇的加入量为 3-6% (w/w)〇
[0011] 步骤（3)所述的平衡缓冲液1组成为0. 01M-0. 02M TRIS，0.1 M-ο. 15M氯化钠，平 衡缓冲液1的PH值为6. 50-7. 50。
[0012] 步骤（5)所述的肝素亲和柱所用填料为Heparin Sepharose 6FF或Heparin S印harose CL-6B ;步骤（5)所述的平衡缓冲液组成2为0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，0. 1M-0. 2M 氯化钠，平衡缓冲液2的PH为6. 50-7. 50 ;所述的洗涤缓冲液组成为0. 01M-0. 02M柠檬 酸钠，0. 25-0. 5M氯化钠，所述洗涤缓冲液的PH为6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液组成为 0. 01M-0. 02M柠檬酸钠，1M-2M氯化钠，所述洗脱缓冲液的PH为6. 50-7. 50。
[0013] 步骤（7)所述的稳定剂为甘氨酸，稳定剂的加入量为0. 5-5% (w/w)。
[0014] 步骤（1)~ (11)所述的人抗凝血酶-III的制备方法，包含S/D、纳米膜过滤及干 热三步病毒灭除方法。
[0015] 本发明的优势 1，本工艺去除了原料中残留的维生素 K依赖的凝血因子，特别去除了凝血酶原，大大 降低了生产过程中蛋白激活的概率，提高了产品合格率； 2, 采用聚乙二醇去除杂蛋白，为后续的柱层析操作提供了较佳的上样条件，减少了层 析柱的负荷； 3, 聚乙二醇是一种蛋白保护剂，在生产过程中可防止蛋白变性失活； 4, 采用三步病毒灭活方法，使产品的临床使用安全性大大提高。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明，实施例只是为了使本领域的技 术人员更好地理解本发明，不可理解为对本发明权力保护范围的限定，相反，对于本领域的 普通科研人员而言，凡利用本发明进行的任何非实质性的改动或调整，均应落入本发明的 保护范围之内。
[0017] 实施例一 1，将3kg组分IV沉淀投入到30kg缓冲液中，缓冲液组成为0. 02M HCL-TRIS，0. 15M 氯化钠，PH7. 50-7. 60,温度控制在10°C，搅拌6小时，使其充分溶解； 2，在以上悬浮液中加入聚乙二醇至6%，搅拌0. 5小时，然后用颇尔公司生产的 Supradur 50P滤板串联0. 45Mm滤芯过滤，收集澄清滤液，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及 滤芯； 3,以上滤液中加入预先溶胀并平衡的DEAE S印hadex A-50凝胶，按干胶计加入33g， 缓冲液组成为0. 02M TRIS-HCL，0. 15M氯化钠，PH6. 50-6. 50 ;缓慢搅拌1. 5小时，后静置5 分钟；然后过滤，收集滤液； 4，以上滤液中加入Tween80至1.0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0.3% (wt%)，搅 匀后升温至24-26Γ，后保温6小时，然后用0. 45μπι滤芯澄清过滤； 5, 以上滤液上