胶原特异结合的单链抗体、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种治疗性抗体，特别涉及一种具有胶原特异性结合能力的单链抗体、其制备方法及在肿瘤治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在动物体内约30%都为胶原蛋白成分，胶原蛋白在细胞的粘附、迀移、分化、增殖等过程中发挥着重要作用，大量研究表明，在肿瘤细胞发生的部位相对于正常组织胶原蛋白过表达，胶原蛋白在肿瘤的发生和转移过程中为肿瘤细胞提供信号转导、物理支架等。目前，针对肿瘤细胞表面靶点的药物越来越多的被发现和研究，并且在体外实验中获得良好的肿瘤细胞的杀伤效果，但是在体内试验中由于肿瘤细胞表面过表达的细胞外基质形成了保护肿瘤细胞的微环境，对肿瘤组织起到了保护作用。细胞外基质成为了肿瘤药物到达肿瘤组织的障碍，大大降低了抗体药物或化学药物到达肿瘤组织的速度和浓度，降低了药效。例如，胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分成为了药物到达肿瘤部位的一个屏障，但是，同时胶原蛋白也成为了肿瘤靶向治疗和制备靶向递送药物载体的重要的新靶点。
[0003]为了提高药物在肿瘤组织的浓度，一般采用两种方法，其中第一种方法是:首先通过使用促进胶原蛋白降解的药物促进肿瘤部位胶原的降解，进而使用针对肿瘤的药物进行治疗。这种方法虽然证实是有效果的，但是靶向性较低，使用范围具有局限性；第二种方法是目前使用较多的方法，使用针对细胞外基质的抗体与具有肿瘤治疗效果的蛋白或者是药物利用基因工程方法改造或者化学交联后，利用抗体的特异性结合靶向递送药物到肿瘤外基质，形成杀伤肿瘤细胞的微环境。但是，利用抗体分子靶向治疗肿瘤时，由于抗体分子量较大，过表达的胶原造成肿瘤组织内压较高，同时实体瘤内部血管较少，抗体药物复合物穿透血管到达肿瘤内部速度较慢，难以起到有效杀伤肿瘤的效果；并且由于在体内循环周期较长，容易引起较大的免疫反应，副作用明显。
[0004]革E1向性多肽的出现很好的弥补了抗体分子作为革G向治疗的缺点，多肽分子分子量较小、结构简单通过化学合成易于获得、氨基酸序列易于分析大大降低了免疫原性，并且组织渗透能力相对于大分子量的蛋白或者抗体要快很多。因此，利用靶向性多肽与治疗性药物结合成为靶向治疗肿瘤或者细胞成像的新方法，从80年代起第一个靶向多肽开始在临床使用，截止到目前已经有50多种靶向多肽被批准临床使用，500多种靶向多肽在临床前研究阶段。西妥昔单抗(cetuximab，商品Erbitux)是抗人表皮生长因子(EGFR)的嵌合型IgGi单克隆抗体，是鼠人嵌合的单克隆抗EFGR抗体，在两个重链上存在两个N-连接的糖基化位点，分子量在152kD左右，它可以与EGFR受体胞外域高亲和力结合，从而竞争性拮抗配体与EGFR的结合，封闭受体与配体的结合从而起到抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活，试验表明，肿瘤细胞或者肿瘤微环境中多种有EGFR信号介导的通路被阻断等，它于2004年被美国食品药品管理局批准使用治疗直肠癌，2006年批准用于治疗头颈部肿瘤。但是此类全长抗体因分子量较大，较难克服肿瘤内压，穿透血管到达肿瘤部位的速度较慢，同时由于全长抗体在体内循环周期较长，容易引起较大的免疫反应，副作用明显；这些因素极大的降低了全长抗体的治疗效果。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种胶原特异结合的单链抗体，其主要由胶原特异结合多肽CBD与西妥昔单抗的scFv功能区融合形成。
[0006]在一更为具体的实施方案之中，所述胶原特异结合的单链抗体(CBD-scFv)是由具有SEQ ID NO: 1所示序列的基因编码形成。
[0007]本发明还提供了用以编码所述胶原特异结合的单链抗体的基因。
[0008]在一更为具体的实施方案之中，所述基因具有SEQ ID NO: 1所示序列。
[0009]本发明还提供了所述胶原特异结合的单链抗体及其编码基因的用途。
[0010]例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种含有用以编码胶原特异结合的单链抗体的基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
[0011]又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了所述胶原特异结合的单链抗体于制备产品中的应用，并且所述产品至少具有下列功能中的一种:检测肿瘤细胞，辅助鉴定肿瘤细胞，预防和/或治疗肿瘤，预防和/或治疗由肿瘤细胞诱发的疾病。
[0012]又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种药物，其包含所述胶原特异结合的单链抗体。
[0013]又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其包含所述胶原特异结合的单链抗体和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点包括:利用酵母表达系统，通过基因工程方法将胶原结合区(CBD，Collagen binding domain)多肽与西妥昔单抗(cetuximab)的功能区scFv (single-chain antibody fragment)融合表达，获得的CBD-scFv在酵母表达系统中上清表达，并且通过体外实验和体内实验证明，CBD-scFv可以与胶原蛋白特异性结合，并且保留了 cetuximab与肿瘤细胞表面的EGFR结合能力以及对肿瘤细胞生长的抑制作用，在体内CBD-scFv可以革El向性的在胶原富集的肿瘤发生部位聚集，并且相对于全长抗体cetuximab能更快的靶向到肿瘤部位，在肿瘤靶向治疗和载药领域有良好应用前景。
【附图说明】
[0015]图1是CBD-scFv和ΝΑΤ-scFv的基因克隆与质粒线性化的电泳图，其中1为NAT-scFv,2 为 CBD-scFv,3 为 pPICZa -CBD-scFv,4 为 pPICZα -ΝΑΤ-scFv ；
[0016]图2a是CBD-scFv的构建模式图；
[0017]图2b是纯化后的CBD-scFv和NAT-scFv的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图；
[0018]图2c是CBD-scFv和ΝΑΤ-scFv与胶原蛋白的结合释放曲线图；
[0019]图3a是CBD-scFv和NAT-scFv与A431细胞表面的EGFR受体的特异性结合的荧光显微镜照片；
[0020]图3b是CBD-scFv和NAT-scFv与EGFR的结合的流式细胞仪检测曲线图，其中实线代表阴性对照，虚线代表试验组；
[0021]图4是MTT法检测CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞增殖影响的曲线图；
[0022]图5a是CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪检测图；
[0023]图5b是CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪检测的统计图；
[0024]图6a图6b分别是肿瘤组织的H&E和Masson染色照片；
[0025]图7是以流式细胞仪分析CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的曲线图；
[0026]图8a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的免疫荧光照片；
[0027]图8b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的免疫荧光照片的荧光平均光密度值/面积统计图；
[0028]图9a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后肿瘤体积变化图；
[0029]图9b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后肿瘤的最终瘤重图；
[0030]图10a是CBD-SCFV、NAT-SCFV和西妥昔治疗四周后的肿瘤组织的免疫荧光染色照片;
[0031]图10b是CBD-SCFV、NAT-SCFV和西妥昔治疗四周后的肿瘤组织的免疫荧光染色的平均光密度值/面积的统计图。
【具体实施方式】
[0032]如前所述，鉴于现有技术存在诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，制备了一种具有胶原特异结合的单链抗体(CBD-scFv)，其中利用胶原特异结合多肽CBD与治疗性抗体的功能区，例如cetuximab的scFv功能区融合表达，并优选采用酵母表达系统成功获得了 CBD-scFv融合抗体片段，该CBD-scFv在体外和体内均具有很好的胶原特异结合能力，并且保持了与EGFR的结合能力和抗肿瘤的活性，CBD-scFv可以很快的在肿瘤发生部位富集，对肿瘤细胞发挥杀伤作用。
[0033]以下结合附图及较佳实施例对本发明的技术方案作更为详尽的说明。
[0034]1、CBD-scFv在酵母菌中的高效表达与纯化
[0035]1、CBD-scFv表达载体的构建
[0036]CBD-scFv抗体的\和V H链由苏州金维智生物科技有限公司合成。然后，利用overlap PCR 将 CBD (TKKTLRT)、VL和 V H拼接成 CBD-scFv 链，连接顺序如下:XhoI+CBD+linker+VL+linker+VH+NotL.进一步的，CBD-scFv 的编码基因序列(SEQ ID NO: 1)如下:
[0037]CTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCAACCAAGAAGACCTTACGCACAAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGTGGCGGTGATATCTTACTGACACAGAGCCCGGTGATCCTG