一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法，及其在农业根结线虫生 物防治中的应用，属于农业微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物病虫害是造成农作物减产的重要原因，每年因病虫害减产的损失巨大，其种 植者为减少病虫害的发生而使用大量化学农药，进而造成病源生物对化学药物的抗药性增 加，形成恶性循环。与此同时，大量使用化学农药造成农作物的品质下降，很多人谈食色变。 在此背景下，高效低毒的生物农药逐渐受到广大农民、生产企业及政府的重视，发展有机种 植业大势所趋，生物农药存在巨大的市场空间。
[0003] 植物线虫病是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材种植的四大病源生物之一，每 年造成世界农业生产的损失约1000亿美元，全球农业上最重要的危害线虫是根结线虫和 胞囊线虫，我国较为严重的线虫有根结线虫、大豆胞囊线虫、小麦粒线虫、甘薯茎线虫、水稻 干尖线虫、栗线虫、松材线虫等，仅我国农作物种植业线虫病损失就达600亿元。
[0004] 淡紫拟青霉能广泛寄生于线虫卵，杀虫效果高效，被认为是最具有应用前景的根 结线虫生防真菌，该菌具有功效高、寄生广、易培养等特点，特别是在控制植物病源线虫方 面功效显著。淡紫拟青霉除了具有杀线虫效果外，还可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘 翅目及鳞翅目等昆虫，另外对植物病原菌(如玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花 枯萎病和水稻恶苗病等)具有拮抗作用。淡紫拟青霉的次级代谢物也有一定的生理效能，如 产生类似吲哚乙酸产物，促进植物根系和植株生长，对种子萌发和生长具有促进作用，还能 产生多种功能酶，并具有一定的化学农药降解效应。
[0005] 淡紫拟青霉作为一种生物制剂，在杀线虫过程中具有安全、高效、持效期长等特 点，其杀线虫的活性并不比化学杀线虫剂差，并有促进植物生长的作用。目前研究资料表 明，淡紫拟青霉菌剂可用于玉米等十几种经济作物、茄子等多种蔬菜、菊花等大量花卉药材 及葡萄等多种果树线虫病的预防和治疗。淡紫拟青霉菌剂与进口的化学杀虫剂相比，杀线 虫效果相当或接近，而其生产成本较低且有后效，并具有不污染农产品和环境的优点。淡紫 拟青霉类环境友好的杀虫菌剂的研发成功对于我国的食品与农作物安全、农业的可持续 发展均具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对上述技术背景及其存在的不足，提供一种农业根结线虫复合生防菌 剂的制备方法，及其在农作物根结线虫生物防治中的应用。以淡紫拟青霉YT08 CGMCC No. 10026为出发菌株，经固态发酵的方法生产农业根结线虫复合生防菌剂，在培养过程中 添加壳聚糖和蟹壳粉等多种诱导因子，激活该菌株的根结线虫侵染因子的生成量，通过多 生防功能因子联合协同作用，提高根结线虫的防治效果。
[0007] 本发明的目的可以通过如下措施来达到： 1. 一株具有防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，该菌株具有高产壳聚糖 酶的特性，其保藏名称为：YT08,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCC No. 10026,分类命名：淡紫拟青霉 iPaecilomyces lilacinus、。
[0008] 2.菌种活化 从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28~30°C、200 rpm下培养 36~48 h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L):蛋白胨5~10,酵母粉 3~5,甘油20~25,粉末壳聚糖1~2,磷酸二氢钾2~3,硫酸镁2~3，磷酸氢二钠2~ 3, pH 6. 5〇
[0009] 3.固态发酵 固体发酵培养基：干啤酒糟17~30%，麸皮4~8%，花生壳粉碎物3~6%，大豆蛋白胨 2~5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）2. 55~7. 5%，蟹壳粉1~2. 25%，NaCl 0. 2~ 0· 5%，CaCl2 0· 1 ~0· 3%，MgS04 0· 1 ~0· 3%，FeS04 0· 05 ~0· 15%，含水量为 40 ~70%。配 制方法：先用水将NaCl、CaCl2、MgS04、FeS04、MnS0 4和大豆蛋白胨溶解，搅拌均勾，再与其他 物质混匀，pH自然。将上述固体发酵培养基装入固体发酵容器中，121°C下蒸汽灭菌15~ 25分钟。
[0010] 按照5~10% (体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的活化种子液倒入固体 发酵培养基中，机械搅拌使菌种与发酵培养基混勾。在30~32°C下静态培养，每隔3~5h 时通入无菌空气1次。培养3~5d后至培养基表层长满菌丝，再次机械搅拌将培养基料捣 碎混匀，在28~30°C下静态培养，每隔5~8小时通入无菌空气1次，继续培养3~4d后 至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵。
[0011] 4.产品成型 发酵终止后通过机械搅拌使培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉 碎，即得淡紫拟青霉YT08的农业根结线虫复合生防菌剂。制备的农业根结线虫复合生防菌 剂经平板培养法确定其活菌数，高效液相色谱法测定其壳寡糖含量。
[0012] 所用的活菌数测定方法：称取lg农业根结线虫复合生防菌剂，加到含有50mL无菌 水的三角烧瓶中，在旋转摇床中振摇l〇min使其充分混匀，然后吸取lmL样液稀释到适当梯 度。取0. lmL稀释的样液均匀涂布于孟加拉红(虎红)显色培养基中，在28°C的恒温培养箱 中培养3d至长出单菌落，计数菌落个数并换算为单位质量的农业根结线虫复合生防菌剂 的总活菌数。
[0013] 所用的壳寡糖含量的测定方法：采用高效液相色谱仪测定，HYPERSIL HS APS 柱，洗脱液为乙腈：双蒸水=3:2,流速0.8 mL/ min，柱温40°C，水解产物0.05 %，上样量 2〇μL，不同聚合度的壳寡糖及氨基葡萄糖单体作为标准对照品。
[0014] 本
【发明内容】
的有益效果在于： 1.淡紫拟青霉ΥΤ08 CGMCC No. 10026是一株对农作物根结线虫具有强防治效果的 丝状真菌，在其固体发酵培养过程中产生大量的壳聚糖酶及部分的几丁质酶等水解蛋白酶 类，作为侵染因子进入根结线虫内部，起到杀灭根结线虫的效果。
[0015] 2.利用淡紫拟青霉YT08高产壳聚糖酶的特性，在菌体发酵过程中添加粉末壳聚 糖诱导产生壳聚糖酶，同时生成的壳聚糖酶又将培养基中壳聚糖降解转化为高生理活性 的低分子量壳寡糖，其对根结线虫有一定的抑制效应，也对多种植物病原虫菌具有抑制作 用，。
[0016] 3.发酵培养基中中添加的粉末壳聚糖和蟹壳粉，除一部分转化为壳寡糖外，还有 部分未降解的壳聚糖、几丁质作为根结线虫生物防治的辅助因子，另外其还可以抑制多种 植物病原菌，与菌体孢子一起形成对根结线虫生物防治的协同效应。
[0017] 4.淡紫拟青霉YT08在发酵过程中还会产生许多的次生代谢产物，其可以促进农 作物生长且对根结线虫及植物病原菌的抑制具有一定的增效作用，这些组分与生成的壳寡 糖以及淡紫拟青霉菌体孢子形成协同效应，提高其对根结线虫的防治效果。
[0018] 本发明的突出优势在于： 1.以啤酒糟、麸皮、花生壳等这些工农业有机废弃物为培养基主要基料，发酵过程中 使用的原料成本较低，产品的市场竞争力明显。
[0019] 2.相对液态发酵来说，固态发酵培养容易，操作方法简单高效，对从业技术人员 的要求不高，且由于淡紫拟青霉YT08对多数病原菌具有抑制作用使其培养过程中不易染 菌。
[0020] 3.本发明中的农业根结线虫复合生防菌剂中以淡紫拟青霉YT08作为杀灭根结 线虫的主要功能组分，培养过程中产生的壳寡糖、壳聚糖酶、几丁质酶以及其它众多的次生 代谢产物也对根结线虫具有一定抑制作用，从而具有协同防治的效果。
[0021] 4.本发明中的农业根结线虫复合生防菌剂除了具有杀灭根结线虫的作用外，还 能促进作物生长，抑制植物病原菌，增强作物根系的健康。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限 制本发明的保护范围。
[0023] 实施例1浅盘培养制备农业根结线虫复合生防菌剂 从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在30°C、200 rpm下培养36h至 菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L):蛋白胨10,酵母粉5,甘油25,粉末壳 聚糖2,磷酸二氢钾3,硫酸镁3，磷酸氢二钠3, pH 6. 5。
[0024] 采用的固体发酵培养基：干啤酒糟30%，麸皮8%，花生壳粉碎物6%，大豆蛋白胨 5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）7. 5%，蟹壳粉2. 25%，NaCl 0. 5%，CaCl2 0. 3%，MgS040. 3%，FeS04 0. 15%，按照培养基组分总质量换算添加纯净水至含水量为40%。配制方法：先 用水将NaCl、CaCl2、MgS04、FeS04、MnS0 4和大豆蛋白胨溶解，搅拌均勾，再与其他物质混匀， pH自然。将上述固体发酵培养基装入固体发酵容器中，121°C下蒸汽灭菌15分钟。
[0025] 按照10% (体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的种子活化液倒入固体发酵 培养基中，通过搅拌使菌种与发酵培养基混匀，放置于霉菌培养箱中培养，表层用事先灭菌 的8层纱布覆盖，在32°C下静态培养，每隔5h时通入无菌空气1次。培养4d后至培养基 表层长满菌丝，然后将培养基物料和菌丝体再次搅拌混匀，在30°C下静态