一种土壤有益微生物混合发酵的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种土壤有益菌株淡紫拟青霉、东方 伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的方法。
【背景技术】
[0002] 随着农业集约化发展、政策的支持以及人们对绿色有机产品的诉求，现代农业迅 速发展的同时也遇到了许多棘手的问题，诸如土壤板结、土传病害严重、连作障碍、作物品 质下降等。大量的化肥农药施入土壤，影响了生态环境和人类健康，而微生物产品正是解决 这些问题的必由之路，尤其是在人类面临能源危机、资源紧缺、环境污染等背景下（李俊， 2006)。微生物产品在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸 收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表 现出了不可替代的作用（葛成，2007)。
[0003] 许多重要的生化过程靠单种微生物是不能完成或只能微弱进行（林静，2004)。复 合微生物制剂含有多种有益微生物菌群，有效菌群可在植物根际优势繁殖，改善了植物根 际微生态环境，其代谢产物及分泌物能刺激作物生长，提高对土壤养分的吸收能力（李阜 棣，1996)。单菌株由于其代谢类型、呼吸类型及作用功能单一，对环境适应能力弱，很难在 土壤中成为优势菌群。而混合有益菌由于菌群组成多样，具有对环境适应能力强，应用范围 广，促生增产效果明显等优点。因此，利用微生物之间的协同作用，构建多菌型微生物制剂 是生物肥料行业研究的热点。
[0004] 土壤有益微生物淡紫拟青霉能够产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶，在植物线虫 病、有害昆虫、植物病原菌的防治等方面均有特别的功效（李芳，2004 ;AlvareZ，2000)。 Bakalivan〇v(1966)发现，淡紫拟青霉可以产生吲哚乙酸，具有促生增产的作用。地衣芽孢 杆菌能够促进土壤中有机物腐殖化，增强土壤肥效，改善土壤板结，提高土壤保温、蓄水和 蓄能性能，抑制病原菌繁殖，降低植物病害等，广泛应用于农业部登记的微生物肥料产品中 (胡云广，2011)。东方伊萨酵母（Kurtzman等人在2008年提出将伊萨酵母归入毕赤酵母， Issatchenkia orientalis东方伊萨酵母，名称已变更为Pichia kudriavzevii库德里阿兹 威毕赤酵母）可作为生防制剂用于拮抗果蔬采后病菌（林晓敏，2015)。相关研究表明，淡 紫拟青霉和地衣芽孢杆菌单独和有机肥复配均具有抗病促生效果（刘会清，2011)。中国专 利201010540183. 8公开了一种速效多菌种微生物复合冲施肥及其制备方法，添加有酵母 菌、地衣芽孢杆菌等土壤益生菌，但其制备方法为各菌株单独发酵后按比例混合。中国专利 201410617387. 5公开了一种用于种植水稻和玉米的微生物菌粉，添加的有益微生物涉及到 地衣芽孢杆菌和酵母菌等，但对于发酵工艺没有特别的说明。中国专利200910038426. 5公 开了一种多功能生物复混肥、其制备方法和应用，添加的有益微生物涉及到三种芽孢杆菌， 采用传统单独液体发酵的形式。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的 方法及其应用。
[0006] 方法的步骤为：
[0007] 1)分别在活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌，将活化好的三株菌 转接到相应的液体培养基上制备种子液。
[0008] 其中，淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus)优选为三炬03号菌株、保藏机构： 中国典型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，.武汉大学；保藏时间2010年6月30 日，保藏编号 CCTCC N0:2010165 ;
[0009] 东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis)优选三炬-06菌株，保藏机构：中国典 型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，.武汉大学；保藏时间2012年11月21日；保 藏编号 CCTCC NO :2012470
[0010] 地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis)优选三炬-10菌株，保藏机构：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，保藏时间2015年4月24日；保藏编号为CGMCC No. 10741。
[0011] 淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌分别优选采用PDA、YPD以及营养琼脂 培养基活化。其中：
[0012] PDA培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH ;ΥΗ)培养基 成分为：酵母膏l〇g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，自然pH ;营养琼脂培养基 成分为：蛋白胨l〇g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，自然pH。
[0013] 淡紫拟青霉经接种后，培养4~6d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液， 用无菌水调节孢子悬液至〇D6。。为0. 2,以10%的接种量将孢子悬液接种到液体培养基中， 28°C、180rpm培养2d，制得淡紫拟青霉种子液，经稀释涂板计数与0D_值的测量，得出淡 紫拟青霉种子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 0. 3386X-0. 0318, R 2 = 0.9803。
[0014] 东方伊萨酵母经过接种后，培养1~2d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三 角瓶，摇匀稀释，测得〇D6。。为0. 2,以10%的接种量接于10mL的液体培养基28°C、160rpm培 养2d，制备东方伊萨酵母种子液，经稀释涂板计数与0D_值的测量，得出东方伊萨酵母种 子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 0. 6703X-0. 0717, R2= 0. 9927。
[0015] 地衣芽孢杆菌经过接种后，培养2~3d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三 角瓶，摇匀稀释，测得〇D6。。为0. 2,以10%的接种量接于10mL的液体培养基30°C、160rpm培 养2d，制备地衣芽孢杆菌种子液，经稀释涂板计数与0D_值的测量，得出地衣芽孢杆菌种 子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 2. 1695X-0. 0659, R2= 0. 9976。
[0016] 2)三株菌分别以5-20%的接种量接种至混合发酵培养基中，根据种子液有效活 菌数与0D6。。值之间的关系，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的有效活菌数高一个数量级。 优选地，地衣芽孢杆菌接种量为0. 1-0. 5亿个/ml发酵液，其它两株菌分别为0. 01-0. 05亿 个/ml发酵液。培养基成分为：蔗糖10~20g/L、大豆粉10~20g/L、磷酸二氢钾1~3g/ L、微量元素0~0.5g/L，起始pH值6. 2-6.8。其中微量元素为氯化钙或硫酸锌或不加。培 养基成分最优为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾lg/L、氯化钙0. lg/L，起始pH值 6. 5〇
[0017] 3) 28°C、180rpm 混合发酵 3d。
[0018] 目前，还没有文献报道淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌混合发酵的方 法。不同属的微生物培养所需的营养物质不尽相同，同时培养容易产生拮抗作用。除了考 虑不同种属微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、无机元素、微量元素、水和氧气等。对于大规 模发酵生产，还须重视培养基原料的价格和来源。传统做法是将不同菌株在各自不同的生 长环境中活化、逐级发酵后离心收集菌体，将各发酵产物混合制成多菌混合产品，具有制备 工艺复杂，成本高，应用受到限制等缺点。
[0019] 本发明的优点是，将三种土壤有益菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽孢杆菌 混合发酵，发酵方法简易高效，发酵过程中发酵液的pH比较稳定；三种菌株能够相互协同 又不产生拮抗作用，在培养基中生长良好，发酵3d后各功能菌有效活菌数多2亿/mL;混 合发酵培养基配方简单，降低了生产成本，提高了设备利用率，适宜于发酵产品的规模化生 产；混合发酵菌剂具有改善土壤菌群平衡，减少化肥农药施用的作用；混合发酵菌剂使用 安全，对环境无污染。
[0020] 三种菌的混菌发酵方法，一方面为发酵产品的规模化生产提供了方法，另一方面， 发酵产品可以和有机物料（腐熟的畜禽粪便、沼渣、蔗渣、泥炭、秸杆等）复配生产生物有机 肥以及和微量