一株产赤霉素的短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其应用，尤其涉及一株产赤霉素的短小芽孢杆菌 及其在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类 植物生长调节剂中的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着经济和社会的高速发展，石油及其制品在国民经济的各个领域中被广泛地应 用，并且使用量与日倶增。但是，在原油的开发、存储、运输和加工环节中，越来越多的石油 烃类污染物进入到土壤，造成了严重的环境和生态问题（2002年，Rahman等）。石油烃类污 染物可阻塞土壤空隙，降低土壤透水和透气性能，破坏土壤物理结构；改变土壤中有机质的 比例（例如碳氮比和碳磷比），导致土壤中有效氮、磷的含量减少；引起土壤微生物群落结 构和区系的改变，破坏土壤微生态环境；影响植物的生长，甚至导致植物的死亡；同时，被 污染植物中的有害物质能够通过食物链危害到人类的健康。因此，石油污染土壤的治理和 修复是目前环境保护领域中的研究热点。
[0003] 污染物的生物处理法是指利用特定的微生物、植物或动物吸收、转化、消除被污 染环境中的污染物，从而对被污染环境进行修复的一种生物处理过程（2002年，Ron and Rosenberg)。其中，微生物是污染降解的主要完成者，已有大量报道从自然环境中分离、筛 选、纯化出具有降解石油烃类和多环芳烃类化合物能力的微生物菌株。例如分离自油田 采出水的食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum)经过诱变处理后可以有效降解 石油经类化合物（2015年，杜茂林等）；分离自胜利油田油井附近土壤中的Pseudomonas sp. DH-5、Citrobacter sp. DH-8以及Klebsiella sp. DH-9可以降解石油中的烷烃类和芳 香烃类化合物，其降解率均在40%以上（2013年，姚瑶等）。除了微生物，植物在修复石油 污染土壤的应用中也取得了一定的研究进展。植物除了可以直接吸收与转化有机污染物之 外，还能够向外界释放分泌物与酶，为根际微生物生长提供基质，同时刺激根际微生物的活 性与转化功能（2012年，杨斌等）。目前，通过植物-土壤-微生物的联合作用实现土壤石 油污染的治理是最具应用前景的方法，与传统的物理法和化学法相比，该方法在成本和应 用效果方面具备无可比拟的优势（2011年，滕应等；2011年，Mukherjee and Bordoloi)。同 时，土壤中还存在着大量的益生微生物，能够产生各种植物生长调节剂促进植物生长。赤霉 素作为一类天然的植物生长调节剂，具有多种生物功能和活性，可以调节植物生根、发芽和 结果等多个过程。该类化合物不仅可在植物中分离得到（1995年，Palavan-tksal )，也可 以由微生物发酵产生（1988年，Martinez-Toledo等；1989年，Bottini等）。分离同时具 备降解石油和产生赤霉素类化合物能力的微生物菌株，并将其应用于含油土壤的生物处理 过程，可以显著强化微生物-植物联合修复系统，实现高效的石油污染物降解和全面的土 壤修复。但目前此工作报道不多，有关短小芽孢杆菌及其在降解石油中的应用或在利用以 原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类植物生长调节剂中的应用未见报道。
[0004] 参考文献
[0005] 1. Rahman K. S. Μ. , Thahira-Rahman J. , Lakshmanaperumalsamy P. , et al. J. Bioresource technology, 2002, 85 (3) : 257-261.
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[0007] 3.杜茂林，付瑞敏，谷亚楠，等.J.微生物学通报，2015, 42 (6) : 1001-1009.
[0008] 4.姚瑶，刘兆普，郑青松，等.J.南京农业大学学报，2013, 36(1) :65-71.
[0009] 5.杨斌，侯新村，范希峰，等.J.环境工程，2012(S2) :406-411.
[0010] 6.滕应，李秀芬，潘澄，等· J. 2011，23(3) :43-46.
[0011] 7. Mukher jee A. K. , and Bordoloi Ν. Κ. J. Environmental Science and Pollution Research，2011，18 (3):471-478.
[0012] 8. Palavan- Unsal N. , J. Bulg. J. Plant Physiol, 1995, 21 (2-3) : 3-14.
[0013] 9. Martinez-Toledo Μ. V. , De La Rubia T. , Moreno J. , et al. J. Plant and soil，1988, 110(1) :149-152.
[0014] 10. Bottini R, Fulchieri M，Pearce D，et al. J. Plant Physiology, 1989, 90 (1) : 45-47.
【发明内容】
[0015] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产赤霉素的短小芽孢杆菌 及其在降解石油中的应用或在利用以原油为主要营养物的发酵培养基发酵生产赤霉素类 植物生长调节剂中的应用。
[0016] 本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株命名为短小芽孢杆 菌（Bacillus pumilus)Yc2_l，该菌株已于2015年9月18日保藏于"中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心"，其保藏编号为CGMCC N0. 11428。
[0017] 上述产赤霉素的短小芽孢杆菌，其生物学特征是：细胞呈现短杆状（见图1)，单 个，细胞大小为（〇. 6 μ m~0. 8 μ m) X (2. 5 μ m~3. 0 μ m);在生孢培养基上培养24小时后 形成短杆状内生芽孢（见图2);固体培养时菌落初期呈圆形，随着培养时间的延长逐渐呈 不规则状，菌落扁平，边缘呈放射状；可在以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基上生长并 产生降解圈（见图3)。生理生化特征是：革兰氏染色阳性，兼性厌氧，化能异养菌，最适生 长温度为30~37°C，最适合生长pH值为6. 5~7. 5。生理生化实验结果详见表1，与短小 芽孢杆菌模式菌株相比完全一致。
[0018] 表1 :Yc2-l菌株（CGMCC N0. 11428)与短小芽孢杆菌标准菌株的生理生化特征比 较
[0020] 注：" + "表示菌株阳性；表示菌株阴性。
[0021] *:东秀珠蔡妙英等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001，第一版。
[0022] 上述用于菌体形态观察的液体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨 l〇g，酵母膏 5g，NaCl 10g，pH7.0。
[0023] 上述用于菌体形态观察的固体培养基组成：每1000ml去离子水中含有胰蛋白胨 l〇g，酵母膏 5g，琼脂粉 15g，NaCl 10g，pH 7.0。
[0024] 上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定 手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
[0025] 上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系 统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
[0026] 对本发明所述短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)Yc2-l CGMCC N0. 11428测定 16S rRNA的基因序列的结果显示，其基因序列长度为1410bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0027] 通过使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus) Yc2_l菌株16S rRNA的基因序列与NCBI注册的多株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)16S rRNA的基因序列具有高度同源性（>97% )，个别菌株的相似性甚至更高，可以确定Yc2-1 菌株是一株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)。选取同源性比较高的典型Β· pumilus的 16S rRNA基因序列作为参比对象；采用邻近法（Neighbour-Joining)运用Mega 5软件构建 Yc2_l菌株与参比菌株之间的系统进化树，选用Pseudomonas aeruginosa作为外群分支， 结果见图4。
[0028] 本发明所述产赤霉素的短小芽孢杆菌Yc2_l菌种的选育方法是：
[0029] 将采集到的石油污染的土壤样品用无菌生理盐水溶解，振荡混匀制成土壤悬液， 梯度稀释后涂布到以石油为唯一碳源的无机盐固体培养基平板上，37°C条件下静置培养， 至有明显的石油降解圈出现，挑取石油降解圈较大的菌落，划线转接到固体培养基上，37°C 条件下静置培养，至有明显的单菌落产生，经两次纯化后，得到短小芽孢杆菌菌种，编号 Yc2-1，甘油冻藏保菌。该菌株已于2015年9月18日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心"，其