快速获得盐生草叶片原生质体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种盐生草原生质体的制备及纯化的方法，特别地是直接通过酶解叶 片而获得较纯的原生质体的方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞原生质体是指去除细胞壁的产物，是真正的单细胞，可应用于远缘亲本 间的融合，易于导入外源基因，同时也是分离各种细胞器（如细胞核，叶绿体，线粒体，液 泡等）的良好材料，并可为细胞间的物质运输，信息交换等的研究提供技术支撑。盐生草 (Halogeton glomeratus)为藜科盐生草属一年生草本稀盐盐生植物，分布于甘肃西部、青 海、新疆及西藏等地区。近年来因其优良的抗旱耐盐性能而受到重视，其本身蕴含的大量抗 旱耐盐相关基因可为作物抗旱耐盐育种提供宝贵基因资源。原生质体具有该细胞的所有生 命特性，并且全能性较易体现，所以原生质体融合育种技术是选育作物优良品种最为有效 的方法之一，而原生质体的成功制备是原生质体融合育种技术的关键所在。目前盐生草研 究在我国相对薄弱，盐生草原生质体的制备工作尚未见报道，因此，采用一种高效经济的方 法制备盐生草原生质体具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种快速获得盐生草叶片原 生质体的方法。该方法简单易行，获得的原生质体纯度高，数量可达8. 4X104个/g，也可避 免组培污染，能为体细胞的杂交，各种细胞器（如细胞核，叶绿体，线粒体，液泡等）的分离， 生物反应器的构建以及原生质体融合育种等奠定基础。
[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速获得盐生草叶片原生质体 的方法，其主要特点在于步骤为：
[0005] (1)幼苗的种植，选取饱满的盐生草种子3-5月种植于花盆，其蛭石与沙子体积比 为 1:1-3:1 ;
[0006] (2)叶片的选取，待步骤（1)获得的幼苗长至1-3个月，用刀片切取靠近植株基部 2/3处的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用；
[0007] (3)原生质体的获得，将步骤（2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵 切，然后放入酶解液中，22-25°C，黑暗条件下酶解2-3h ;
[0008] (4)原生质体的纯化，在步骤（3)酶解后的酶解液中加入等体积的洗液，放置在黑 暗条件下，22-25°C，25-40rpm的水平摇床10-15min，然后用5ml的移液枪将酶解液吸入 l〇ml的试管，接着将其放入22-25°C的离心机2000-3000r离心8-10min，最后用移液枪吸取 4-5ml的上清液，即为纯的原生质体；
[0009] (5)原生质体产量的测定，轻轻吹打步骤（4)所述原生质体，使其分布均匀，用移 液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平 均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每 克叶片原生质体数表示（个/g)。
[0010] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（1)所述的幼苗在自然条件 下生长，輕石与沙子120-180°C灭菌4_6h，并每隔3_5d喷洒一次1/2 Hoagland-Hoagland 营养液。
[0011] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（2)所述选取的叶片为靠近 植株基部2/3处，颜色深绿，肉质化严重，并且在10-30min内使用。
[0012] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（3)所述的酶解液的组成： 纤维素酶10_30g/L，半纤维素酶5-20g/L，果胶酶5-20g/L，离析酶2-5g/L，甘露醇60-85g/ L，10mM的MES 50-150ml/L，等体积混合，PH为5-6 ;所述的步骤（4)洗液的组成：甘露醇 60-85g/L，10mM 的 MES 50-150ml/L 等体积混合，PH 为 5-6。
[0013] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（3)所述的原生质体的获 得，在制备原生质体时，清洗后叶片表面用滤纸擦干，然后用刀片在10-30min内沿主脉纵 切，接着用镊子拨入盛有酶解液的玻璃培养皿中，酶解液用超纯水配制，调PH用Κ0Η或HC1。
[0014] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（4)所述的纯化原生质体 时，用l〇ml的圆底塑料试管以及水平转子的离心机，2000-3000r离心8-10min，离心后，将 溶液静止，时间为5-10min，再吸取4-5ml的上清液，最后在倒置显微镜下观察原生质体的 情况。
[0015] 所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其步骤（5)所述原生质体直径为 10um-150um之间，原生质体共存于洗液当中。
[0016] 本发明的有益效果如下：
[0017] 1.以1-3个月盆栽苗的叶片为材料直接酶解获得原生质体，方便简单，省时省力， 避免了通过组织培养方法获得原生质体的麻烦以及组培污染。
[0018] 2.根据盐生草叶片的特点优化了酶解体系与条件，获得的原生质体产量大，纯度 尚，活性强。
[0019] 3.通过直接酶解叶片来获得原生质体，其特性与自身植株的特性一致，对研究更 具有说服力。
[0020] 4.通过一次离心就可获得较纯的原生质体，效果良好，杜绝了多次离心造成的浪 费，节省成本。实现了简单、易行、高效获得盐生草原生质体的目标。
[0021] 5.最终获得的原生质体大小各异，直径在10um-150um之间，并且纯度高，数量可 达 8. 4X104个/g。
【附图说明】：
[0022] 图1.盐生草叶片的酶解；
[0023] 图2.分离纯化得到的原生质体；
[0024] 图3.实施例1得到的原生质体；
[0025] 图4.实施例2得到的原生质体；
[0026] 图5.实施例3得到的原生质体；
[0027] 图6.实施例4得到的原生质体。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
[0029] 实施例1 : 一种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其主要特点在于步骤为：
[0030] (1)幼苗的种植，选取饱满的盐生草种子4月种植于花盆，其蛭石与沙子体积比为 1:3 ；
[0031] (2)叶片的选取，待步骤（1)获得的幼苗长至3个月，用刀片切取靠近植株基部 2/3处的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用；
[0032] (3)原生质体的获得，将步骤（2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵 切，然后放入酶解液中，22°C，黑暗条件下酶解2h ;
[0033] (4)原生质体的纯化，在步骤（3)酶解后的酶解液中加入等体积的洗液，放置在黑 暗条件下，22°C，30rpm的水平摇床15min,然后用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的试管， 接着将其放入22°C的离心机2500r离心10min，最后用移液枪吸取5ml的上清液，即为纯的 原生质体；
[0034] (5)原生质体产量的测定，轻轻吹打步骤⑷所述原生质体，使其分布均勾，用移 液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平 均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每 克叶片原生质体数表示（个/g)。
[0035] 其步骤（1)所述的幼苗在自然条件下生长，蛭石与沙子160°C灭菌4_6h，并每隔5d 喷洒一次 1/2 Hoagland-Hoagland 营养液。
[0036] 其步骤（2)所述选取的叶片为靠近植株基部2/3处，颜色深绿，肉质化严重，并且 在30min内使用。
[0037] 其步骤（3)所述的酶解液的组成：纤维素酶20g/L，半纤维素酶15g/L，果胶酶 15g/L，离析酶4g/L，甘露醇75g/L，10mM的MES 120ml/L，等体积混合，PH为5-6 ;
[0038] 所述的步骤（4)洗液的组成：甘露醇75g/L，10mM的MES 120ml/L等体积混合，PH 为 5-6〇
[0039] 其步骤（3)所述的原生质体的获得，在制备原生质体时，清洗后叶片表面用滤纸 擦干，然后用刀片在30min内沿主脉纵切，接着用镊子拨入盛有酶解液的玻璃培养皿中，酶 解液用超纯水配制，调PH用Κ0Η或HC1。
[0040] 其步骤⑷所述的纯化原生质体时，用10ml的圆底塑料试管以及水平转子的离心 机，2300r离心9min，离心后，将溶液静止，时间为8min，再吸取4ml的上清液，最后在倒置显 微镜下观察原生质体的情况。
[0041] 其步骤（5)所述原生质体直径为10um-150um之间，原生质体共存于洗液当中。见 图3
[0042] 实施例2 :-种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，取3个月盆栽苗的叶片，用 蒸馏水冲洗三次，滤纸将其表面擦干，沿主脉纵切，然后在25°C，黑暗条件下酶解3h后，在 培养皿中加入等体积的洗液，接着在黑暗条件下，放入25°C，30rpm的水平摇床15min，再 用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的试管，并将其放入25°C的离心机2000r离心10min， 用移液枪吸取5ml的上清液，倒置显微镜下观察，最后轻轻吹打上述原生质体，使其分布均 匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三 次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结 果以每克叶片原生质体数表示（个/g)。
[0043] 酶解液的配制：纤维素酶10g/L，半纤维素酶5g/L，果胶酶5g/L，离析酶2g/L，甘露 醇 60g/L，10mM 的 MES 50ml/L，PH 为 5-6。
[0044] 洗液的配制：甘露醇60g/L，10mM的MES 50ml/L等体积混合，PH为5-6。
[0045] 结果：原生质体产量为8. 37 X 104个/g (见表1)，纯度高，质膜完整，受损少，状态 好，最终得到污染少，产量大，纯度高，比较理想的原生质体。见图4
[0046] 实施例3 :-种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，取2个月盆栽苗的叶片，用 蒸馏水冲洗三次，滤纸将其表面擦干，沿主脉纵切，然后在25°C，黑暗条件下酶解2. 30h后， 在培养皿中加入等体积的洗液，接着在黑暗条件下，放入25°C，30rpm的水平摇床12min，再 用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的试管，并将其放入25°C的离心机2500r离心10min， 用移液枪吸取4ml的上清液