人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充 质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成 纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支 持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原 性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势， 因此，探讨MSCs体外大量扩增具有深远意义。
[0003]目前骨髓间充质干细胞的体外扩增多采用二维培养方式进行的，也有部分采用三 维细胞培养支架进行培养，但均是采用单一的三维细胞培养支架，由于单一的三维细胞培 养支架存在机械性能弱，不稳固等问题，因此，在培养过程中，容易从三维细胞培养支架的 三维培养方式转变成二维培养方式，从而使得骨髓间充质干细胞活性差，扩增不明显。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用单一的三维支架培养骨髓间 充质干细胞的方法因支架机械性能弱，不稳固等造成骨髓间充质干细胞扩增率不高、细胞 活性差等缺陷，提供一种能够采用两种及以上三维支架的人工模拟骨髓微环境进行骨髓间 充质干细胞的培养方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工模拟骨髓微环境培养 骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
[0006] 获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；
[0007] 其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖，或胶原和赖氨酸组合制成；或， 所述三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛三者共同制成的。
[0008] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述三维 细胞培养支架中还添加有纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨。
[0009] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶 原和壳聚糖制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：
[0010] 将胶原溶于乙酸溶液中，配制胶原溶胀液；将壳聚糖溶于乙酸中，配制壳聚糖溶 液，然后将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合脱泡，冷冻并冻干。
[0011] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶 原和赖氨酸制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：
[0012] 将胶原溶于乙酸溶液中制成胶原溶胀液，经真空脱泡，冷冻并冻干处理后，浸泡于 含有赖氨酸的MES溶液中，然后再添加 EDAC交联剂和含NHS氨基酸保护剂，交联处理后漂 洗，然后冷冻并干燥。
[0013] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，由所述胶 原、壳聚糖和戊二醛制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤：
[0014] 将胶原溶于乙酸溶液中，配制成胶原溶胀液；并用乙酸溶液配制壳聚糖溶液，然后 将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合并放置于真空中干热交联后浸泡于戊二醛溶液中，继续交 联8-16个小时后，漂洗，冷冻并冻干。
[0015] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细 胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。
[0016] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，获取骨髓 间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步 骤：
[0017] 将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至IX 106~IX 10 8个/25ml，加入所述培养基 进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后， 加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1 :2~1 :3比例接种进行传代培养至细胞生长 到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。
[0018] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，采用三维 细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干 细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1 X 10s~1 X 10 w个/L细胞浓度与复溶后三维细胞培 养支架共同接种于所述培养基中进行培养。
[0019] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，三维细胞 培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂，且所述助溶剂的质量分数为5% -15%。
[0020] 在本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法中，所述培养 基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10 6~10 smol/L的氢化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。
[0021] 实施本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，可以达到 以下有益效果：通过采用壳聚糖或赖氨酸，或是采用壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性， 以提高三维细胞培养支架的机械性能，使其不易被酶解，并利用其三维多孔结构维持骨髓 间充质干细胞体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长 的骨髓微环境，并提高三维细胞培养支架的细胞黏附性，使得骨髓间充质干细胞能够黏附 在三维细胞培养支架的多孔结构上生长，扩大了细胞与培养基的接触面积，从而达到提高 骨髓间充质干细胞的细胞活性及增值率，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架 培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。
【具体实施方式】
[0022] 为解决现有技术中采用单一的三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在细 胞活性差，增殖率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种采用两种及以上的三维细胞培 养支架以人工模拟骨髓微环境进行培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了单一的三维细胞 培养支架机械性能弱、不稳固、生物相容性差、不利于细胞黏附等问题，从而可真正实现骨 髓间充质干细胞的三维培养，不仅能够提高骨髓间充质干细胞的活性，而且还能够提高骨 髓间充质干细胞的扩增率。
[0023] 具体地，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括 以下步骤：
[0024] S1、获取骨髓间充质干细胞；
[0025] S2、采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，三维细胞培养支架是 由胶原和壳聚糖，或由胶原和赖氨酸组合制成；或，三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和 戊二醛三者共同组合制成。
[0026] 胶原具有无抗原性、及良好的生物相容性，其本身所包含的细胞黏附信号肽序列 可以引导骨髓间充质干细胞对胶原支架的特定识别，有助于保持骨髓间充质干细胞的表型 及活性，但由胶原单独制作而成的胶原支架存在易酶解、机械性能差、细胞黏附性相对较弱 等缺陷。本发明的创新点在于通过采用壳聚糖或赖氨酸对胶原进行改性，能够提高胶原的 抗酶解能力，改善胶原的力学性能，提高支架材料的机械性能及孔隙率。另外，通过引入戊 二醛和胶原的氨基酸残基以及胶原的Η原子发生反应，通过这些反应使胶原分子相互连接 形成交联的互穿网络，这样不但可以提高材料的机械性能，还可以延缓生物材料的降解速 率；而壳聚糖的引入能够大大减缓胶原支架的降解速度，以满足细胞对支架材料降解的要 求。
[0027] 而由壳聚糖制成的壳聚糖水凝胶或壳聚糖改性水凝胶均具有生物功能性亲水表 面，可促进细胞黏附、增殖；两者分别单独作为三维细胞培养支架材料存在机械性能弱，不 能保持既定性状，可塑性不强，不能很好的模拟骨髓微环境的缺陷；而由壳聚糖与胶原支架 共同制成的三维细胞培养支架，则能够增强三维细胞培养支架的机械性能，及生物相容性 及细胞黏附性，促进骨髓间充质干细胞的黏附生长及增殖，另外，胶原支架也能够使骨髓间 充质干细胞保持其干细胞特性。
[0028] 进一步地，为提高三维细胞培养支架的机械性能，本发明提供的三维细胞培养支 架中还包括纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨；其中，纳米晶胶原基骨具有三维孔洞网络结构， 机械强度较好，且具有一定的生物相容性；而脱细胞软骨是生物新鲜组织经过物理方法处 理，脱去组织中的所有细胞、抗原等物质后所得到的产物，主要包括胶原支架、弹性蛋白、非 胶原支架糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖，具有良好的生物相容性、柔韧性、低抗原性，在体外 培养过程中无降解变形，保留了培养前的结构，且保留了大量对细胞黏附、增殖有利的蛋白 多糖和II型胶原支架等，其力学性质与天然的软骨很相近，还具有能提供对细胞黏附有益 的信号分子。
[0029] 进一步地，步骤S1中还包括原代骨髓间充质干细胞的获取，及原代骨髓间充质干 细胞的传代培养，具体为：
[0030] S11、原代骨髓间充质干细胞的获取：