一种基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明专利涉及分子生物学技术领域，具体地说是一种基于HMGR 3' -UTR和rRNA ITS的引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二单酰辅酶A 生成甲羟戊酸，HMGR是刺五加苷生物合成中的限速酶。刺五加苷是五加皮和刺五加的有效 成分，也是品种鉴别和质量鉴定的目标化合物。mRNA 3'端非编码区（3'-UTR)是mRNA编 码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A)的前端的一段核苷酸序列。真核生物 的3' -UTR在基因表达调控中发挥重要作用，可调控mRNA的稳定性、控制其翻译、协助辨认 密码子等，3'-UTR在不同基因和不同物种中间具有高度特异性，还可以作为分子标记，特别 是植物的次生代谢相关酶。内转录间隔区（ITS)是rDNA中18S rRNA基因和28S rRNA基 因之间的序列。rDNA上的5.8S、18S和28S rRNA基因有极大的保守性，即存在着广泛的异 种同源性。而ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力 非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态 性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异。研究表明，ITS片段 的进化速率是18S rDNA的10倍。这就是ITS序列应用在中药材鉴定分析中的理论基础。
[0003] 五加皮系五加科植物细柱五加的干燥根皮，为常用中药。又名白刺、目骨、追风使、 南五加皮等。该植物主要分布于湖北，河北，安徽，四川等地。五加皮性温，味辛、苦，归肝、 肾经，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、通游血、利水肿、镇痛解热等功效，临床主要用于治疗风 湿瘦痛、腰膝软弱、小儿行迟、跌打，骨折等病症，为常用的重要中药材之一。现代研究证明 本品还具有抗肿瘤、抗疲劳、降低全血粘度、防止动脉粥样硬化形成等作用。
[0004] 香加皮亦称北五加皮，来源于萝蘑科植物杠柳的干燥根皮，为常用传统中药。本品 性温，味辛苦，有毒，归肝、肾、心经。有祛风湿、强筋骨的功效。用于风寒湿痹，腰膝酸软， 心悸气短，下肢浮肿。主产于甘肃、陕西、河南、山西等地。与五加皮药理作用有异，药物功 效也不相同，五加皮有补肺肾、强筋骨、祛风除湿的功效；香加皮虽也有柱风湿、强筋骨的功 效，但与五加皮作用机制不同。香加皮中含有杠柳毒苗，它有剧烈的强心作用但同时又为毒 性成分，过量服用甚至会导致死亡。2010版《中国药典》一部五加皮项下仅规定了性状、显 微鉴别、水分、总灰分等检查项，不能准确鉴别，因此应用分子标记和基因工程技术鉴定五 加皮和香加皮能够精确的辨别、鉴定，避免混淆。
【发明内容】
[0005] -、引物序列 本发明提供了一种基于HMGR 3'-UTR和rRNA ITS的引物及其应用。用于鉴定的引物 为： 1、基于五加皮 HMGR 3'_UTR 的引物：上游 FI :5'_ggcatcatgtactaggatacagtcg_3' ，下游 F2 :5'_ catagtcagactgaatgtaatctgtctac-3' 2、 基于五加皮 rRNA ITS 的引物：上游 F3 :5'_cacgacgtgtgcacgactctagtacg_3' ，下游 F4 :5'_ctgcgtcgctatacgagacgatgccac_3' 3、 基于香加皮 rRNA ITS 的引物：上游 F5 :5'_cggactagtgcgagtatcgtcgcag_3' ，下游 F6 :5'_ggcatgcactcagcagtgaatgcacg_3' 采用DNA合成仪对上述引物进行合成，即得到鉴定引物的白色晶体。
[0006] 上述引物序列经NCBI的nucleotide blast比对后Max score均不超过41，Query cover均不超过75%，并且在公布的五加科植物中未检出Query cover超过50%的序列，说 明引物序列特异性高；最大Max score和Query cover数据如下：
二、引物序列获得的方法 1、同源序列的获得和同源引物设计 通过NCBI进行检索，分别获得刺五加（注册号JQ905593)、拟南芥(注册号： AY488113)、三七（注册号：KP702301)、人参（注册号：⑶565098)、西洋参（注册号： FJ755158HMGR)的HMGR序列并在NCBI上应用blast进行同源序列分析，再采用Clustal X 软件进行多序列同源性比对，根据HMGR 0RF区的保守区设计HMGR同源PCR引物（HMGR引 物序列：上游 Fa :5'_agtaaattcagggggagtcata_3' 和下游 Fb :5'_caccattttcaactttaactgg tg-3'），该引物在后续五加皮DNA样品PCR中验证能够扩增得到DNA片段，说明PCR引物在 五加皮同样具有保守性。18S rRNA在不同物种间具有高度保守性，通过NCBI进行检索，分 别获得刺五加（注册号：AB080245)、拟南芥（注册号：X16077)、三七(注册号：AB027525)、人 参(注册号：D83275)、西洋参(注册号：D85172)18S rRNA基因序列，并在NCBI上应用blast 进行同源序列分析，再采用Clustal X软件进行多序列同源性比对，根据18S rRNA的保守 区设计同源 PCR 引物（18S rRNA 引物：上游 Fc :5' -ggtcgacgcgggctctggct-3' 和下游 Fd : 5'-gcggttcgccgccggcgacgtcg-3'），该引物在后续五加皮和香加皮DNA样品PCR中验证能够 扩增得到DNA片段，说明PCR引物在五加皮同样具有保守性。
[0007] 2、样品总RNA提取 分别取五加皮和香加皮鲜根组织100 mg置于研钵中，加入1.0 mL Trizol充分研磨， 研磨过程中不断加入液氮。将匀浆移入1.5 mL EP管，冰浴5分钟。每管加入0.2 mL氯仿， 震荡15 s，冰浴2~3 min。12000 r/min，4°C离心5 min，吸取上清液移入1.5 mL新EP管 中，加入0. 5 mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混勾，冰浴10 mirul^OOO r/min，4°C离心5 min， 弃去上清液，加1 mL 75% DEPC水配制的乙醇，震荡拍匀使RNA沉淀重新悬浮。12000 r/ min，4°C离心5 min，缓慢倾倒EP管弃去上清液，超净工作台下EP管倒置于无菌吸水纸上， 自然干燥30 min，加入0. 1% DEPC水20~50 μ L混匀、溶解RNA，-80°C冰箱中保存备用。
[0008] 3、总 RNA 检测 取琼脂糖粉末80 g和l.OXTAE 80 mL置于三角烧杯中，然后放于微波炉中缓慢加热， 直至琼脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈现透明液体状态，取出烧杯，自然冷却至50°C ~60°C 之间时，加入极少量的EB，轻轻摇动烧杯使其混匀溶解，再沿着凝胶槽边缓缓倒入已插入梳 子的凝胶槽，等待10~20min后完全冷却凝固后，拔出梳子。
[0009] 取RNA样品5 μ L和1 μ L Lording buffer混合均勾后加入凝胶块样品孔，置于 电泳槽中80 V电泳1.5 h，取出凝胶块置于凝胶成像系统中观察RNA分离情况。另取5 μ L RNA样品溶解于690 yL蒸馏水中，混匀，紫外分光光度计中测定0D值。取RNA样品0D26。/ 0D2SM>1. 8进行后续实验操作。
[0010] 4、3' -RACE 扩增获取 0RF 下游 UTR 和 ITS (1) 反转录合成cDNA第一链 在100μLPCR管中建立3'-RACEcDNA第一链合成体系（如下表)，其中3'-CDS引物为 试剂盒所带引物：
将以上反应体系混匀，70°C水浴120s后，冰浴120s，迅速离心后分别加入下表的试剂。 混合各组分并离心，恒温金属浴中42°C反应90 min，每管中加入0. lmL TE缓冲液稀释反应 体系，72 °C反应7min，所得样品-70 °C保存。
(2) RACE PCR 反应 按照下表加入各成分，其中通用引物是与CDS配对的引物，3'-RACE的上游引物(试剂 盒所带引物)，3' GSP为3' -RACE的下游引物，即为上述设计合成的引物Fa和Fb (或Fc和 Fd)。变性温度94°C，退火温度55°C，每循环一次温度下降1°C，总共30循环。
5、PCR产物测序 采用高通量测序仪Hiseq 2500对PCR产物进行测序。五加皮HMGR样品测序数据包括 部分ORF和全部3'-UTR序列。五加皮和香加皮18s rRNA样品测序数据包括部分18s rRNA 序列和3'下游部分ITS序列。测序所得五加皮HMGR 3'-UTR序列如序列表SEQ ID NO. 1、 五加皮 rRNA ITS SEQ ID NO. 2、香加皮 rRNA ITS 的引物 SEQ ID NO. 3。
[0013] 6、引物设计及BLAST检验 将测序数据利用NCBI的BLAST功能进行序