小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用

文档序号:9560526阅读:1641来源:国知局
小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域,具体地说,涉及小麦TaAG04a基因的 CRISPR/Cas9载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为一种重要的粮食作物,全世界有35%-40%的以小麦为主要粮食。同时 作为三大谷物之一,产量几乎全做食用,是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着分 子生物学技术的不断发展和对基因功能研究的逐步深入,表观遗传学如DNA甲基化、组蛋 白修饰等在修饰基因、调控基因表达进而控制重要农艺性状如千粒重、开花等,发挥重要作 用。AG04a是AGO大家族成员,通过介导sRNAs参与DNA甲基化路径,进而调控相关基因的 表达。AG04蛋白作为RdDM路径的核心组分不仅参PAMP (pathogen-associated molecular pattern)启动的基础抗性,同时参与抗病基因介导的小种专化抗性。最新研究则显示,拟南 芥接种细菌后,包括AG04、AG06在内的10个RdDM路径组分的表达均下调,这种基因表达下 调直接导致了一个受甲基化调控的NLR(N0D-like rec印tor)类抗病基因 RMG1的上调,进 而启动抗病反应。说明包括AG04在内的整个RdDM路径在植物抗病反应中发挥重要作用。 在小麦中AG04a基因有三个拷贝,分别位于3A、3B和3D染色体上,分别命名为TaAG04a-A、 TaAG04a-B和TaAG04a-D。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解AG04a如何在小麦抗 病中的发挥作用,揭示其工作原理。
[0003] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/ Cas (CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统,通 过序列特异的RNA介导,切割降解外源性DNA,包括噬菌体和外源质粒,致使目的基因功能 的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统,其最 大的特点是操作简单、成本低、作用高效,是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编 辑新技术。2013年,科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功,随后,在斑马鱼、 果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(double strand break, DSB),细胞可通过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)进 行修复,导致基因发生移码突变,丧失功能。除此之外,该系统还能与同源重组载体、寡聚核 苷酸共同作用,使靶基因发生高效的精确修饰。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为 基因编辑工具中的佼佼者,在基因功能研究等领域得到广泛的应用。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一种小麦的CRISPR-Cas9载体及其在制备TaAG04a基因突变 的转基因小麦中的应用。
[0005] 本发明首先根据TaAG04a_A、TaAG04a_B和TaAG04a_D的cDNA保守序列设计一个 长度为20bp的gRNA,该gRNA位于TaAG04a第三个外显子上,中间具有一个酶切位点,为 XmnI 〇
[0006] 具体地,本发明提供的特异性靶向小麦TaAG04a基因第三外显子的gRNA的DNA序 列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID N0. 2所示。
[0007] 本发明提供了上述gRNA在制备小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体中的应用。
[0008] 本发明利用gRNA所构建小麦TaAG04a基因的CRISPR/Cas9载体,可以对TaAG04a 的三个拷贝,分别位于3A、3B和3D染色体上进行基因编辑,从而引起该基因发生移码突变, 致使功能部分或全部缺失。
[0009] 进一步地,本发明提供了上述gRNA在制备TaAG04a基因突变的转基因小麦中的应 用。
[0010] 含有本发明所述gRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9载体属于本发明的保护范围,其 能够特异地针对小麦TaAG04a基因。
[0011] 进一步地,本发明的CRISPR/Cas9载体,其通过以下方法制备得到,将SEQ ID NO. 1、2所示的寡聚核苷酸在95°C,5min,从95°C开始降温,每分钟降低1°C,历时70min降 至25°C,在10°C下保持;U6-sgRNA骨架载体用限制性内切酶Bbsl进行酶切过夜,回收后, 与退火的寡聚核苷酸连接。
[0012] 本发明提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_A引起基因移 码突变的应用。
[0013] 本发明提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_B引起基因移 码突变的应用。
[0014] 本发明提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_D引起基因移 码突变的应用。
[0015] 更进一步地,本发明提供了上述小麦TaAG04a基因 CRI SPR/Cas9载体在制备 TaAG04a基因突变的转基因小麦中的应用。
[0016] 本发明提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在制备抗病力提高的小麦 中的应用。
[0017] 本发明还提供了用于检测CRISPR/Cas9_TaAG04a基因突变的引物组合,其核苷酸 序列如SEQ ID N0. 3-4所示。
[0018] 本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-4所示的引物组合在检测CRISPR/ Cas9_TaAG04a基因突变中的应用。
[0019] 具体地,上述应用包括以下步骤:
[0020] (1)提取待测小麦原生质体DNA,用XmnI酶切;
[0021] (2)以酶切产物为模板,以SEQ ID N0. 3-4所示的核苷酸序列为引物进行PCR,PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测,若目的片段大小为956bp,回收PCR产物,用XmnI酶切回收产物, 此时没有被切的片段为阳性,发生切割的则没有突变产生,为阴性。
[0022] 本发明通过构建TaAG04a基因的CRISPR/Cas9载体,实现部分沉默或同时沉默 TaAG04a基因,对研究该基因参与DNA甲基化路径的功能和对小麦抗病研究。进一步了解小 麦抗病中由RdDM介导的机理,对未来培育小麦抗病新品种有重要作用。
【附图说明】
[0023] 图1A-图1E为TaAG04a基因三个拷贝的同源序列比对图。*是指TaAG04a_A、 TaAG04a-B和TaAG04a-D三个拷贝间相同的序列。
[0024] 图2为TaAG04a的gRNA连接到CRISPR/Cas9系统的载体上,通过测序验证正确连 接结果。虚框线是gRNA序列,通过多个样品测序说明gRNA已经正确连接。
[0025] 图3为Xmn I酶切割PCR产物的琼脂糖凝胶图,1泳道为DNA marker ; 2泳道为 未转化CRISPR/Cas9-AG04a载体的野生型TaAG04a,为对照;3、4泳道为转化CRISPR/ Cas9-AG04a载体后,互为重复。2泳道中上面的亮度较弱的条带大小为956bp,下面的较亮 条带约为470bp和486bp(由于大小相差很小,电泳图中区分不是很明显)。3和4泳道分 别为被Cas9编辑过后,经过XmnI酶无法切割,表明该片段为阳性突变,3和4的条带分别为 956bp〇
[0026] 图4A-图4C为CRISPR/Cas9_AG04a载体切割目的基因引起突变,经过测序确定突 变类型。图中AG04A1-3-11-A/D的描述中,1-3-11是编号顺序,A/D是说明该基因可能在 A基因组上也可能在D基因组上。WT-AG04A-D是野生型该基因的序列。Consensus是指序 列一样的。其中图4A中的AG04A1-3-11-A/D和野生型WT-AG04A-A和WT-AG04A-D相比缺 失2个碱基,分别是AT,AG04A1-3-17-A/D和野生型WT-AG04A-A和WT-AG04A-D相比缺失 3个碱基,分别是AAG ;AG04Al-3-21-A/D和野生型WT-AG04A-A和WT-AG04A-D相比,缺失1 个碱基,为C。图4B中,AG04al-3-2-B和野生型WT-AG04A-B相比,缺失六个碱基,分别为 AAGCCA ;AG04al-3-3-B 和野生型 WT-AG04A-B 相比,缺失 2 个碱基,分别为 AT ;AG04al-3-8-B 与野生型WT-AG04A-B相比,缺失2个碱基,分别为CA。图4C中,AG04A1-10-A/D与野生型 WT-AG04A-A 和 WT-AG04A-D 相比,插入 67 个碱基,分别为 CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTT TCCATAGGCTCCGCCCCGTCCACTTCATCATATTTAAA。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
[0028] 若未特别指明,实施例中所用的材料、生物化学试剂均为常规市售试剂,实施例中 所用的技术手段为本领域技术人员熟知常规手段。
[0029] 实施例1小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9的gRNA设计
[0030] 1、小麦TaAG04a基因三个拷贝序列的比对
[0031] 以中国春小麦(Triticum aestivum L. )AG04a基因的三个拷贝序列用DNAMAN进 行比对,结果如图1A-图1E所示。
[0032] 2、小麦TaAG04a基因酶切分析
[0033] 以中国春小麦AG04a基因序列用Primer 5. 0进行酶切位点和数量的分析,尤其关 注在三个拷贝保守的序列,和在目标区间内存在单一酶切的位置。
[0034] 3、寻找 PAM (proto adjacent motif)基序
[0035] 在合适的酶切位置附件寻找PAM基序,即NGG。保证酶切位置刚好位于NGG的5' 端4-6碱基处。
[0036] 4、确定gRNA序列
[0037] 确定合适的PAM位置,在其5'端20bp的一段序列即为gRNA序列,一般小麦 CRISPR/Cas9中使用U6启动子来转录sgR
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