用于高效利用蔗糖的基因表达载体及工程菌与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及透明质酸生产领域，尤其是用于高效利用蔗糖的基因表达载体及工程 菌与应用。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸，是一种线性大分子酸性粘多 糖。由于透明质酸具有的特殊的生理功能如保湿作用、润滑作用、对细胞的保护作用、对组 织和血管生成的作用、对肿瘤的防治作用、对创伤愈合和止血等方面的作用。故此，HA在医 药、化妆品和一些特殊食品中都有广泛的应用。
[0003] HA的工业化生产主要有从动物组织（主要是鸡冠）中提取和利用细菌微生物法 生产。从动物组织中提取HA，面临着的主要问题有：由于其本身组织中HA浓度低而导致的 产量低的问题；提取过程中不可控制的降解作用的问题；HA与蛋白多糖复合使得提取高纯 度、高分子量的HA的代价十分昂贵的问题等。自1937年Kendall等首次发现溶血型链球 菌可以产生透明质酸，又随着报道发现生产透明质酸的其他微生物菌株，分别有A类，B类 和C类。研究结果表明C类兽疫链球菌条件致病性弱，是目前发酵法生产透明质酸的理想 菌种。利用兽疫链球菌发酵生产透明质酸具有成本低、提取工艺简单等特点，现已形成规模 化生产，有广阔的市场前景。
[0004] 蔗糖因其来源于高等植物组织，是自然环境下最丰富的二糖，而且许多真细菌都 有催化蔗糖代谢的酶，比如蔗糖-6-磷酸水解酶和蔗糖特异性转化酶。对于兽疫链球菌来 说，工业上用蔗糖作为底物来发酵生产透明质酸是最经济的。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用于高效利用蔗糖的基因表达载 体。
[0006] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供采用上述表达载体构建的高效利用蔗 糖生产透明质酸的工程菌。
[0007] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述工程菌的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0009] 蔗糖特异性磷酸转移系统基因表达载体，是将长度为2191bp的scrA基因 (包含其自身启动子PSCT)插入基因表达载体PLH243的多克隆酶切位点处形成的载体 PLH243: :Ps"-SCrA，所述scrA基因的核苷酸序列为序列表400〈1>所示序列，所述基因表达 载体PLH243的核苷酸序列为序列表400〈7>所示序列。
[0010] 优选的，上述蔗糖特异性磷酸转移系统基因表达载体，所述scrA基因来源于兽疫 链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920 基因组。
[0011] 优选的，上述鹿糖特异性磷酸转移系统基因表达载体，所述scrA基因始于起始密 码子ATG上游187bp，结束于终止密码子TAA下游120bp。
[0012] 蔗糖-6-磷酸水解酶基因表达载体，是将长度为1775bp的sacA基因（包含其自 身启动子PSJ插入载体PLH243的多克隆酶切位点处形成的载体pLH243: :Psa。-sacA，所述 sacA基因的核苷酸序列为序列表400〈4>所示序列，所述基因表达载体pLH243的核苷酸序 列为序列表400〈7>所示序列。
[0013] 优选的，上述蔗糖-6-磷酸水解酶基因表达载体，所述sacA基因来源于兽疫链球 菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920 基因组。
[0014] 优选的，上述蔗糖-6-磷酸水解酶基因表达载体，所述sacA基因始于起始密码子 ATG上游198bp，结束于终止密码子TAG下游137bp。
[0015] 采用上述表达载体构建的工程菌，为重组菌株ScrA/OP，是所述蔗糖特异性磷酸转 移系统基因表达载体电转入宿主菌获得的，所述宿主菌为兽疫链球菌ATCC 39920。
[0016] 采用上述表达载体构建的工程菌，为重组菌株SacA/OP，是所述蔗糖-6-磷酸水解 酶基因表达载体电转入宿主菌获得的，所述宿主菌为兽疫链球菌ATCC 39920。
[0017] 上述工程菌--重组菌株ScrA/OP和/或重组菌株SacA/OP以蔗糖为底物发酵生 产透明质酸方面的应用。
[0018] 优选的，上述工程菌的应用，所述工程菌的发酵培养基为：蔗糖50g/L，酵母提取 物 3. 5g/L，酪蛋白胨 10g/L，NaCl 1. 5g/L，K2HP042g/L，MgS04 · 7H200. 4g/L ;
[0019] 摇瓶发酵条件为：100mL装液量，接种量2%，37°C，pH 7. 0,转速200r/min，发酵 24h ；
[0020] 所述工程菌的发酵条件为：500mL摇瓶，装液量100mL，接种量2%，37°C，pH 7. 0， 转速200r/min，发酵24小时。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、本发明利用基因工程技术克隆了蔗糖特异性磷酸转移系统和蔗糖-6-磷酸 水解酶编码基因，并成功构建在兽疫链球菌里稳定复制的表达载体PLH243: :Psa-scrA和 PLH243: :Psa。-sacA，将其分别电转到兽疫链球菌野生型感受态中获得了重组菌株SacA/OP 和 ScrA/0P ;
[0023] 2、本发明同时对WT、ScrA/OP和SacA/OP进行摇瓶发酵培养，分析透明质酸产量和 蔗糖残余量，研究结果发现一株可以高效利用蔗糖生产透明质酸的工程菌SacA/OP，其HA 产量比WT高20%左右，而蔗糖的利用提高了 15%左右。可以有效降低底物蔗糖对兽疫链 球菌生长及其生产透明质酸的抑制。
【附图说明】
[0024] 图1是本发明中蔗糖特异性磷酸转移系统表达载体；
[0025] 图2是本发明中蔗糖-6-磷酸水解酶表达载体；
[0026] 图3是本发明中蔗糖特异性磷酸转移系统基因表达载体的菌落PCR验证图，其中， Μ为DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，以基因组为模板，1和2为PCR扩增scrA基 因，大小为2191bp ;
[0027] 图4是本发明中蔗糖特异性磷酸转移系统基因表达载体酶切验证图，其中，Μ为 DNA Marker ;1和2为EcoR I和Pst I双酶切验证质粒；
[0028] 图5是本发明中蔗糖-6-磷酸水解酶基因表达载体的菌落PCR验证图，其中，Μ为 DNA Marker，N为阴性对照，P为阳性对照，以基因组为模板，1和2为PCR扩增sacA基因， 大小为1775bp ;
[0029] 图6是本发明中蔗糖-6-磷酸水解酶基因表达载体酶切验证图，其中，Μ为DNA Marker ;1和2为Sal I和Sph I双酶切验证质粒；
[0030] 图7为本发明中构建的菌株ScrA/OP、SacA/OP以及WT摇瓶发酵合成HA的产量。
[0031] 图8为本发明中构建的菌株ScrA/OP、SacA/OP以及WT摇瓶发酵蔗糖残余量。
【具体实施方式】
[0032] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0033] 以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920 基因组为模板，将编 码蔗糖特异性磷酸转移系统和蔗糖-6-磷酸水解酶的基因 scrA和scaA分别克隆至载体 PLH243上，并经过菌落PCR如图3和图5、双酶切如图4和图6和测序验证后，成功构建了 蔗糖特异性磷酸转移表达载体PLH243: : Psra-scrA如图1和蔗糖-6-磷酸水解酶表达载体 pLH243::Psa。-sacA如图2。将两个表达载体分别电转至宿主菌兽疫链球菌ATCC 39920野 生型菌株中，成功获得过表达菌株ScrA/ΟΡ和SacA/OP，经过对上述重组菌进行发酵分析， 发现与野生型相比ScrA/ΟΡ的蔗糖的利用减少11%左右，透明质酸的产量下降14%左右； SacA/OP的蔗糖利用提高了 15%左右，而HA产量比WT高20%左右。故本研究得到一组可 以高效利用蔗糖生产透明质酸的工程菌SacA/OP。
[0034] 发酵生产透明质酸的方法是：将WT、ScrA/OP和SacA/OP菌株分别接种到FSB液 体培养基中，经发酵培养，每4小时收集一次发酵液，经样品处理和分析得到其透明质酸产 量和蔗糖残余量如图7和图8 ;所述的发酵培养条件为温度为37°C，培养时间24h，pH值为 7. 0以及转速200r/min。具体内容如下：
[0035] -、蔗糖特异性磷酸转移表达载体和蔗糖_6磷酸水解酶表达载体的构建
[0036] 以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC 39920 基因组为模板，在 scrA基因起始密码子ATG上游187bp处设计引物scrA-F，在终止密码子TAA下游120bp处 设计引物scrA-F ;在sacA基因起始密码子ATG上游198bp处设计引物sacA-F，在终止密码 子TAG下游137bp处设计引物sacA-R。
[0037] PCR 反应体系为：10 X PCR Buffer 5 μ L，dNTP (2mM) 5 μ L，MgS04 (2 50mM) 2 μ L，上游 引物和下游引物（10 μ M)各1. 5 μ L，模板1 μ L，KOD-Plus DNA聚合酶（东洋纺株式会社， 3462003) 1 μ L，加无菌水至终体积为50 μ L。
[0038] PCR 反应条件为：94°C预变性 2min，94°C变性 15s，58°C退火 30s，68°C延伸 2min， 反应35个循环，68°C后延伸10min。
[0039] 用上述PCR体系扩增获得完整的scrA和sacA目的片段核苷酸序列，其核苷酸序 列如序列表400〈1>和400〈4>所示。
[0040] 表1所用引物序列 [0041 ]
[0043] 表1中，scrA-F的核苷酸序列为序列表400〈2>所示序列，scrA-R的核苷酸序列为 序列表400〈3>所示序列，sacA-F的核苷酸序列为序列表400〈5>所示序列，sacA-R的核苷 酸序列为序列表400〈6>所示序列。
[0044] 将扩增获得的scrA和sacA基因片段用EcoR I/Pst I和Sph I/Sal I分别进行 双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段PLH243分别进行连接，pLH243的核苷酸 序列为序列表400〈7>所示序列。
[0045] 将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素抗性 (50 μ g/ml)的LB平板上，37°C培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，如 图3,图4和图5,图6所示。并经测序比对正确，获得载体pLH243: :Psra-scrA如图1和 pLH243: :Psac-sacA 如图 2〇
[0046] LB培养基：
[0047] 胰蛋白胨：10. 0g，酵母浸出物：5. 0g，NaCl :10. 0g，去离子水溶解后，定容至1. 0L， p