使用ⅲ型nad激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用III型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。使用 III型NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂 含量。本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。
【背景技术】
[0002] 微藻是一类介于微生物与高等植物细胞之间的单细胞生物，具有叶绿体等光合作 用器官，能有效利用太阳能将水、〇)2和无机盐转化为有机物。微藻具有对光能的利用率高， 生长速度快，对生长环境要求低，能源物质（油脂、烃）含量高等优点，被公认为最具发展潜 力的第三代生物能源原料。此外，微藻的固碳效率是植物的10倍以上，可解决co2的点源 排放问题，是国内外生物固碳之首选；微藻生长过程需要大量的N/P等营养，是净化富含N/ P废水的有效途径；除能源物质外，微藻含有大量蛋白、多糖、色素、多不饱和脂肪酸等生物 活性成分，其应用面广、价值高。微藻生长所需要的阳光取之不歇、所需碳源正是人类亟待 大量固定的C02、所需营养正是造成我国水体大面积富营养化的N/P，而利用微藻为原料加 工而成的能源、饲料和食品等产品的市场需求量极大。
[0003] 野生型的微藻通常油脂含量并不高，通过调控培养工艺，使得藻类细胞在逆境中 生长（例如缺氮、高光、高盐等条件下），可以显著提高油脂含量，但是不可避免的牺牲藻细 胞的生长。因此，人们尝试采用基因工程技术来调控藻细胞内油脂的合成与积累。微藻基因 工程研究在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)中取得了重要的进展，在三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)、杜氏盐藻（Dunaliella salina)以及小球藻（Chlorella) 等微藻上也有了不同程度的研究。然而，通过基因工程技术提高真核微藻细胞内油脂含量 的研究相对较少。在美国ASP计划实行期间，曾有科学家将硅藻acc基因转入小环藻，尽管 在转录水平检测到过量表达，但是总油脂含量并未提高。近年来，有学者转入DGAT基因，使 得藻细胞内油脂含量提高。也有科学家转入植物的转录调控因子，例如大豆的Dof4和拟南 芥（Arabidopsis thaliana)的LEC1基因，但采用这些方法提高油脂或脂肪酸含量的幅度 普遍不大。
[0004] NAD (H)和NADP (H)是一种关键性的辅酶，在所有生物中发挥重要的作用并且分工 明确，NAD/NADP的平衡影响着代谢以及活性氧的体内平衡。细胞内很多氧化还原过程需要 NAD(H)和NADP(H)的参与，例如脂肪酸的从头合成。调节胞内NAD(H)和NADP(H)之间的 平衡是至关重要的。其中，起这种调节作用的一种关键酶是NAD(H)激酶，可催化NAD(H)以 ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP(H)。NADPH不 仅被用于卡尔文循环，氮吸收，油脂和叶绿素代谢，还有维持氧化还原平衡的功能。
[0005] NAD激酶（EC 2. 7. 1. 23 ;NADK)只能专一性的结合NAD+，使其磷酸化生成NADP+， 这是NADP+生物合成途径的最后一步。根据磷酰基受体的不同，NAD激酶被分为poly (P)/ ATP-NAD激酶和ATP-NAD激酶。不同于NAD激酶的专一性，NADH激酶（EC2. 7. 1. 86 ;NADHK) 不仅可以催化NAD+，还可以催化NADH发生磷酸化形成NADPH，但是优先利用NADH作为底 物。在拟南芥中，已克隆到了由At3g21070、Atlg21640和Atlg78590分别编码的NADK1、 NADK2和NADK3。其中，NADK1和NADK2只能专一性的磷酸化NAD，而NADK3却能编码NADH 激酶，优先利用NADH，对NAD的亲和力却很低。
[0006] 对这3种酶的功能以及亚细胞和组织定位的结果显示，NADK1位于胞质中，主要在 根部细胞表达，NADK2定位于叶绿体基质，主要在叶子细胞表达。但关于NADK3却存在争 议，Chai等的实验中显示NADK3定位在细胞质中，并认为NADK3提供了细胞质内绝大部分的 NADPH ;而另一组实验显示NADK3定位于过氧化物酶体，而过氧化物酶体需要大量的NADPH， 所以NADK3很可能给过氧化物酶体提供还原力。过表达拟南芥的NADK2提高了 NADP (H) 浓度，其提高有助于促进植株的氮吸收，以及与卡尔文循环有关的代谢物积累，并伴随着 Rubisco活力的提高。这些研究暗示了 NADK作为转基因植物中的候选基因，在维持细胞 内氧化还原平衡、促进初始代谢和抗逆性方面具有潜在应用价值。但目前尚未检索到利用 NADK3基因（AtNADK3)转化藻类并提高脂肪酸和油脂含量的研究报道。
【发明内容】
[0007] 本发明发现过表达拟南芥AtNADK3基因可以使微藻细胞内NADPH含量增多，进而 使得脂肪酸和油脂含量显著提高。
[0008] 与现有技术相比，本申请的技术方案有如下优势：（1)微藻生长快、光合固碳效率 高，当前微藻生物技术已步入快速发展阶段，除了把微藻开发成传统意义上的新食品原料、 功能食品外，随着新能源、碳减排和环保等方面的迫切需要，微藻在生物能源、生物固碳、 富含N/P废水、动物饲料及食品等行业具有广阔的应用前景。尤其是在生物能源与固碳 减排方面，微藻具有无可比拟的独特优势；（2)针对于蛋白核小球藻，本实验室创立了一项 微藻培养领域崭新的平台技术一一 "异养一稀释一光诱导"技术（参见中国专利申请号 200610025618. 9,《高密度高品质培养小球藻的方法》，该专利通过引用全文并入本申请）， 按照目前的培养工艺，蛋白核小球藻的平均生长速率不低于3g/L/h，即蛋白核小球藻的培 养工艺更加成熟；（3)本申请使用蛋白核小球藻的内源性热激蛋白（HSP)70启动子，相对于 外源性启动子（例如CaMV 35S启动子、SV40启动子或pCMV启动子），内源性启动子的优点 是不利于导致基因沉默，更加有利于外源基因的表达。
[0009] 因此，鉴于脂肪酸和油脂合成需要细胞内提供足够的还原力NADPH，并且野生型微 藻普遍存在油脂含量低等缺点，本发明的技术方案具有重要的应用前景。
[0010] 本发明涉及使用III型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。III型 NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂含量。 本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。
[0011] 根据本申请的一个方面，本申请提供了使用III型NAD激酶提高微藻中油脂或脂肪 酸含量的方法。
[0012] 根据本申请的某些实施方式，所述方法构建包含III型NAD激酶的表达载体，将所 述表达载体转化到微藻细胞内表达。
[0013] 根据本申请的某些实施方式，所述III型NAD激酶包含经修饰的III型NAD激酶，或者 III型NAD激酶的嵌合蛋白、截短蛋白或蛋白结构域。
[0014] 根据本申请的某些实施方式，所述III型NAD激酶包含与III型NAD激酶的相同性为 至少约70 %的序列。
[0015] 根据本申请的某些实施方式，所述III型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3激酶。
[0016] 根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的基因包含如SEQ ID N0:1所示 的序列。
[0017] 根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶包含如SEQ ID N0:2所示的序列。
[0018] 根据本申请的某些实施方式，所述转化III型NAD激酶的微藻中油脂的含量提高了 至少约45%。
[0019] 根据本申请的某些实施方式，所述转化III型NAD激酶的微藻中脂肪酸的含量提高 了至少约2倍。
[0020] 根据本申请的某些实施方式，所述表达载体选自表达载体pGreen、pBI121、 pBIN19、pCambial300、pGreenOOOO、或 pBlueScript 系列载体。
[0021] 根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029载体。
[0022] 根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029-HSP载体。
[0023] 根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子，所述启动子选自热激蛋 白（HSP)启动子、泛素启动子、或N0S启动子。
[0024] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。
[0025] 根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。
[0026] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性启动子。
[0027] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性HSP70启动 子。
[0028] 根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗生素抗性基因。
[0029] 根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导 法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
[0030] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0031 ] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9。
[0032] 根据本发明的另一个方面，本申请提供了III型NAD激酶在提高微藻细胞中脂肪酸 和油脂含量的应用。
[0033] 根据本发明的另一个方面，本申请提供了III型NAD激酶在通过微藻细胞生产脂肪 酸或生物柴油中的应用。
[0034] 根据本申请的某些实施方式，所述III型NAD激酶包含经修饰的III型NAD激酶，或者 III型NAD激酶的嵌合蛋白、截短蛋白或者蛋白结构域。
[0035] 根据本申请的某些实施方式，所述III型NAD激酶包含与III型NAD激酶的相同性为 至少约70 %的序列。
[0036] 根据本申请的某些实施方式