一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统及其方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤免疫治疗是通过增强抗肿瘤免疫力来治疗恶性肿瘤的，近年来的临床试验取得了令人瞩目的成果。其中，用针对特异性靶标的T细胞受体(TCR)开展的抗肿瘤T细胞免疫治疗获得了长足进展，已开始进入临床试验，获得了客观疗效。早期T细胞治疗的临床试验，多采用抗肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)的方式，结果显示只在一些肿瘤如黑色素瘤里存在比较多量的TIL，在体外扩增回输到患者体内有明显的肿瘤消除作用。由于免疫耐受和肿瘤微环境抑制作用，在多数肿瘤组织中TIL的数量是有限的，而且多数是耗竭的T细胞(exhausted T cell)。
[0003]能引起抗肿瘤T细胞反应的抗原种类包括:(1)机体外源性抗原或体细胞基因突变产生的新抗原；(2)没有基因突变免疫耐受不完全的自身抗原，在肿瘤细胞异常表达。T细胞在胸腺发育成熟的过程中，会对间质细胞表达和呈递的自身抗原不产生免疫应答，这种机制称为中央耐受。在中央耐受机制的作用下，T细胞经历阴性筛选，即一些对自身抗原有高亲和力的T细胞克隆被清除，产生的正常T细胞库不会对自身组织产生免疫反应。而多数肿瘤相关抗原(TAA)本身就是未发生基因突变的在肿瘤细胞异常表达的自身抗原，由于免疫耐受机理，所以T细胞对这些TAA不能够发生有效的免疫反应。
[0004]为了克服免疫耐受，并得到高亲和力的抗肿瘤TCR基因，李亮平等在德国分子医学中心(Max Delbrueck Center for Molecular Medicine，MDC)，构建了人 TCR-HLA 人源化小鼠(ABabDII)，利用该小鼠模型分离到了一系列高亲和力肿瘤抗原特异性的TCR基因。这些TCR基因可以用于抗肿瘤T细胞免疫治疗:通过TCR基因转移的方法改造原代T细胞，将普通的淋巴细胞转变为特异识别肿瘤抗原的T淋巴细胞，然后在体外大量扩增回输至病人体内，用于临床治疗。基因工程化的T细胞免疫治疗最大的好处在于，可以修饰和增强T淋巴细胞的功能短期内产生打量抗肿瘤T细胞，以达到治疗目的。用肿瘤抗原特异性TCR基因修饰的T细胞，不但在转移性恶性黑色瘤病人身上取得良好的效果，而且在滑膜肉瘤，B-细胞淋巴瘤(B-CLL)，肾癌和结直肠癌等的过继免疫治疗也获得肿瘤消退。
[0005]TCR基因治疗存在着一些问题:目前抗肿瘤TCR基因通常用逆转录病毒载体转导至T细胞，由于病毒转导是多拷贝且随机整合的过程，有可能会灭活抑癌基因、活化原癌基因而诱发白血病，同时转导进去的TCR链可能会与内源性的TCR链随机组合可能形成自身反应性的TCR分子，从而诱发自身免疫性疾病，如:移植物抗宿主疾病(GVHD)。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种Dual-RMCE介导的单拷贝TCR基因置换系统，避免逆转录病毒基因随机插入带来副作用，同时结合胚胎干细胞(ES)或诱导多潜能干细胞(iPS)体内外分化技术，获得肿瘤抗原特异性的T细胞。
[0007]本发明的第二个目的是提供利用上述系统进行TCR基因置换的方法。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换系统，包括含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体PMP71-LGFPF、含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF和Cre/Flp酶载体pDIRE-1Cre/Flpoo
[0009]传统基因置换方式是基因敲入，主要是通过同源重组载体DNA转染，在细胞同源重组的机制作用下在基因原位进行基因置换。但同源重组的效率太低，大约107?10 4οDual-RMCE是重组酶介导的基因组定点高效基因置换技术，利用目的基因片段两侧DNA交换组件(Loxp、FRT等)能够特异性地被重组酶(Cre、Flp酶等)识别，并导致交换组件间整个DNA片段的置换。交换组件在自然界只存在于噬菌体中，在原核生物和真核生物基因组中不存在。因此，在真核生物基因组中首先引入交换组件，进行RMCE介导的基因置换时，只在置换组件处发生基因交换。具体过程为:将重组酶编码的质粒载体和含有交换组件的感兴趣基因供体质粒，转入含有预先植入交换组件的细胞中；重组酶识别基因组和供体质粒中含有相同方向的特异性位点(如:Cre酶识别Loxp序列，Flp酶识别FRT序列等)，使交换组件和被置换的基因DNA片段发生交换(图1)。
[0010]为了实现TCR基因交换，我们结合逆转录病毒转导TCR基因技术和Dual-RMCE技术。首先构建稳定的TCR逆转录病毒转导系统。将该系统转导靶细胞通过筛选即可获得含有置换组件的单细胞克隆，该单细胞克隆可直接用于TCR基因置换。
[0011]本发明还提供利用上述置换系统进行基因置换的方法，包括以下步骤:
51.构建含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71_LGFPF；
52.构建含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF;
53.将逆转录病毒整合载体PMP71-LGFPF转导入哺乳动物细胞中，筛选并获得单克隆细胞，再将含有TCR基因置换载体和Cre/Flp重组酶载体pDIRE-1Cre/Flpo共转入所述单克隆细胞中。
[0012]优选地，S1的操作为:用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述引物从pSR-GFP/Neo扩增Notl-Loxp-EFGPneo-FRT-EcoRI片段，酶切后连接于pMP71载体上。
[0013]优选地，S2的操作为:用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所述引物扩增MAGEA1-TCR-1367基因，酶切后连接于pDRAv_3上。
[0014]优选地，S3所述哺乳动物细胞选自人T细胞系、人胚胎干细胞系或多能干细胞系。
[0015]优选地，S3所述单克隆细胞的筛选过程为:将逆转录病毒载体PMP71-LGFPF导入293T细胞中进行病毒包装，待病毒滴度为5X107时，按照病毒数:细胞数为1:10的比例转导入哺乳动物细胞系(如T细胞)或胚胎干细胞系(如ES细胞)中，通过G418抗性和绿色荧光蛋白筛选获得单克隆。
[0016]本发明还提供利用上述置换方法获得的肿瘤抗原特异性T细胞。
[0017]本发明还提供上述TCR基因置换方法在肿瘤免疫治疗中的应用；所述TCR基因(指任何2A元件连接的TCR基因)可以是针对任何肿瘤抗原的TCR。
[0018]近年来的临床研究显示，TCR基因治疗存在一些困难。T细胞基因修饰需要比较多的原代τ细胞，获取大量的肿瘤病人Τ细胞有一定难度；TCR基因修饰后的T细胞体外扩增能力有限。为了解决这一难题，一些研究人员开展干细胞TCR基因修饰的研究。造血干细胞(HSC)在体内外有比较大的增殖潜能，能够分化为T细胞。由HSC分化的淋巴祖细胞在分化成T细胞的过程中，存在TCR等位基因的排斥效应(Allelic Exclus1n)。当用逆转录病毒技术将TCR基因转导进入HSC后，已重排的TCRa β基因可以抑制未重排的内源性TCRa β链基因位点的重排。实验表明外源性已重排的TCR基因几乎可以完全抑制内源性TCR基因重排，内源性TCR基因不能表达，结果大部分的Τ细胞只表达转入的外源性TCR，这样能够得到大量单一抗原特异性的Τ细胞，以排除内外源性TCR错配带来的副作用。
[0019]现有技术已经表明造血干细胞可以在实验室产生抗原特异性的Τ细胞。但干细胞基因修饰存在致癌的风险，由于该方法利用高滴度的逆转录病毒上清，转导至造血干细胞，导致TCR基因多拷贝且随机整合入基因组中，有可能导致插入突变。之前干细胞基因治疗的临床试验研究表明，临床治疗需要大量输入逆转录病毒基因修饰的干细胞，大约需要10s?109个肥(:。这些细胞中，有极少数细胞转入的基因插入会导致灭活抑癌基因或激活原癌基因，经过体内长期筛选，极少数突变的细胞大量增殖形成白血病。鉴于此，我们提出分离基因修饰后的