纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质n末端分离的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用纳米金修饰的材料用于蛋白质N末端分离的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质N末端的氨基酸起点常与数据库中的起始位点不同。蛋白质在翻译和加工过程中，N端可能涉及到RNA的剪切，多种可选的翻译起点，信号肽的切割，以及各种化学层面的翻译后修饰等过程，而导致蛋白质N末端的复杂性。鉴定蛋白质N末端序列对于理解蛋白质的生物功能等具有重要意义。
[0003]目前，蛋白质N末端的方法主要基于正向富集和反向去除策略。正向富集策略的主要原理是先在蛋白质N末端引入特异性基团，经胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用相应的材料对蛋白质N末端进行特异性地分离。反相去除策略主要原理是先在蛋白质层面进行所有的氨基全封闭，经过胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用非N末端肽段上的游离氨基，结合氨基反应材料去除非N末端肽段，并对蛋白质N末端肽段进行分离富集。反相去除方法相较正向富集方法，有望富集到更多因化学修饰而导致游离氨基封闭的N末端，然而，去除材料的效率相对略有不足。因此，许多研究合成不同的可离去基团修饰的材料，包括三氟乙磺酸基材料等，利用氨基的亲核性对非N末端肽段进行去除。
[0004]为进一步提高非N末端肽段去除效率，需要探索更高效的去除材料。有文献表明，利用特劳特试剂(Traut’s Reagent)可以对氨基进行高效快速的巯基衍生，而同时，利用金和硫可以在温和的条件下形成牢固的金硫键。巯基衍生和金硫键形成均为加成反应，因此，体系中不会引入多余的盐类，减少除盐过程中样品损失，且不影响质谱的鉴定。若体系中的非N末端肽段可以得到高效的巯基衍生并被金修饰的材料分离，则可以实现蛋白质N末端的高效分离鉴定。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。
[0006]本发明提供的纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤为: 首先，合成纳米金修饰的石墨稀(GOPDAOAu)；
然后，对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解；
然后，用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；
最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-ToF)进行蛋白质N末端的检测。
[0007]本发明中，所述合成纳米金修饰的石墨稀的具体步骤如下:
(1)取一定质量石墨烯分散在10 mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ; (2)将多巴胺包覆的石墨烯(GOPDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ;
(3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入终浓度为0.1-0.5 mM无水合氯金酸，加热至85-90°C后，加入5-10 mM柠檬酸三钠，保持加热1小时以上(一般为1_2小时)，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥，得到纳米金修饰的石墨烯。
[0008]本发明中，所述对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解的具体步骤日下；
(4)将蛋白溶于高浓度(一般为4Μ以上，如为4 Μ-10Μ)盐酸胍中，用等体积40-100 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5-8 mM 二硫苏糖醇，60°C以上(一般为60-80°C )反应至少0.5小时(一般为0.5-1小时)后，再加入2-2.5倍浓度(相较于二硫苏糖醇)的碘乙酰胺，闭光反应0.5-1小时，再加入20-60 mM甲醛和10-30 mM氰基硼氢化钠反应4_16小时；
(5)用三乙胺碳酸氢盐(pH7.2-8.5)对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上(一般为2-3次)置换动作，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为蛋白的2.5%-5%，进行过夜酶解；
本发明中，所述用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集的具体步骤为；
(6)取一单位质量蛋白酶解液加入0.2-20倍单位质量特劳特试剂，20-60°C下反应0.5小时以上或过夜；
(7)在上述混合液中加入200-600倍质量的GOPDAOAu，20-60°C下反应1.5-2.5 h，取上清液。
[0009]最后进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定。
[0010]本发明中，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析与常规分析相同，具体步骤为，取0.1 yg蛋白酶解液于革巴板上，再在蛋白革巴点上添加1 yL 4 mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，待液体干燥后，进入机器进行分析。
[0011]利用本发明方法可以实现蛋白质N末端肽段高效快速地分离。
【附图说明】
[0012]图1为GOPDAOAu透射电镜图。
[0013]图2为实验流程示意图。
[0014]图3为人血浆白蛋白经氨基封闭后酶解液非N末端肽段去除前后MALD1-ToF图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1:
一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤如下:
(1)取一定质量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ;
(2)将多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ;
(3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM无水合氯金酸，加热至85°C后，加入10 mM柠檬酸三钠，保持加热1 h后，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥待用；
(4)将人血浆白蛋白溶于6Μ盐酸胍中，用等体积50 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5 mM二硫苏糖醇，60°C反应45分钟后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，闭光反应一小时，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氢化钠反应6小时；
(5)用25mM三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次置换动作，加入2.5%胰蛋白酶，进行过夜酶解；
(6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍质量特劳特试剂，60°C下反应1.5 h ;
(7)在上述混合液中加入200-400倍质量的G@PDA@Au，60°C下反应2.5 h，取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定，得到人血浆白蛋白N末端肽段1205.5 Da0
[0016]实施例2:
一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤如下:
(1)取一定质量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ;
(2)将多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ;
(3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM无水合氯金酸，加热至85°C后，加入10 mM柠檬酸三钠，保持加热1 h后，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥待用；
(4)将牛血浆白蛋白溶于6Μ盐酸胍中，用等体积50 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5 mM二硫苏糖醇，60°C反应45分钟后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，闭光反应一小时，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氢化钠反应6小时；
(5)用25mM三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次置换动作，加入2.5%胰蛋白酶，进行过夜酶解；
(6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍质量特劳特试剂，60°C下反应1.5 h ;
(7)在上述混合液中加入200-400倍质量的G@PDA@Au，60°C下反应2.5 h，取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定得到牛血浆白蛋白N末端肽段(1249.6 Da)。
【主权项】
1.一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，其特征在于，具体步骤为: 首先，合成纳米金修饰的石墨稀; 然后，对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解； 然后，用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集； 最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质N末端的检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的合成纳米金修饰的石墨烯的具体步骤如下: (1)取一定质量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ; (2)将多巴胺包覆的石墨烯(GOPDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定质量GOPDA分散在50-100ml水中，加入终浓度为0.1-0.5 mM无水合氯金酸，加热至85-90°C后，加入5-10 mM柠檬酸三钠，保持加热1小时以上，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥，得到纳米金修饰的石墨烯。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解的具体步骤如下； (1)将蛋白溶于高浓度盐酸胍中，用等体积40-100mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5_8 mM二硫苏糖醇，60°C以上反应至少0.5小时后，再加入二硫苏糖醇2-2.5倍浓度的碘乙酰胺，闭光反应0.5-1小时，再加入20-60 mM甲醛和10-30 mM氰基硼氢化钠反应4_16小时； (2)用pH7.2-8.5的三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上置换动作，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为蛋白的2.5%-5%，进行过夜酶解。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集的具体步骤为； (1)取一单位质量蛋白酶解液加入0.2-20倍单位质量特劳特试剂，20-60°C下反应.0.5小时以上或过夜； (2)在上述混合液中加入200-400倍质量的GOPDAOAu，20-60°C下反应1.5-2.5 h，取上清液，用于供基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体为一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。本发明方法步骤为，首先合成纳米金修饰的石墨烯（GPDAAu），再对氨基封闭后的蛋白进行酶解，对酶解液进行巯基衍生后，利用GPDAAu对衍生上巯基的非N末端肽段进行去除，最后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质N末端的检测。本发明方法可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。
【IPC分类】C07K1/14, C12P21/06, G01N27/64
【公开号】CN105316381
【申请号】CN201510796026
【发明人】张祥民, 李兰婷
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月18日