一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法

文档序号:9560582阅读:622来源:国知局
一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,更具体地,本发明涉及一种通过基因阻断提高链霉菌 的土霉素产量的方法。
【背景技术】
[0002] 链霉菌的生命周期很复杂,能够产生多种次级代谢产物。这些天然产物为新药的 发现提供了丰富的前体物资源。至1995年为止,由链霉菌中得到的具有抗生素活性的次级 代谢产物约有7000种。链霉菌产生的抗生素在医药和生命科学研究中得到广泛应用。链 霉菌以其特有的发育分化特征和强大的次级代谢能力,在基础研究与工业应用方面均具有 重要地位。抗生素的合成与大量调控因子相关,这些调控因子通过调控抗生素合成途径中 的相关基因的表达量,调控了抗生素的产量。这为进一步利用这些调控因子作为靶点进行 基因改造,获得抗生素商广突变菌株,从而实现抗生素广量的提商提供了肯能。
[0003] 龟裂链霉菌(Streptomyce rimosus)是土霉素(oxytetracycline,OTC)的商业化 生产菌株。土霉素属于四环素类广谱抗生素,能够抑制对革兰阳性菌、阴性菌、支原体、衣原 体、立克次体等引起的感染,同时也可用于治疗梨形虫病、附红细胞体病。其作用机理是土 霉素能够可逆性地与30S核糖体亚基结合,从而抑制氨酰tRNA核糖体复合体的形成,这样 抑制了细菌的繁殖。因此研究人员不断应用分子技术对S. rimosus进行研究,利用重组技 术改造菌株性能、提高抗生素产量,或者以此为骨架合成生产非天然新抗生素。然而,为了 提高土霉素的产量,本领域还有必要进一步研究提高土霉素产量的方法。
[0004] 链霉菌的次级代谢产物的生物合成基因常位于同一基因簇中,在基因簇中常包含 一个或多个途径特异性调控基因,它们一般调控一种抗生素或几种具有某些共同生物合成 途径的抗生素的生物合成。抗生素生物合成基因簇的调控是受位于基因簇的转录调控子 (CSR)在转录水平上进行调控的,通常有单转录调控子调控和多转录调控子调控。
[0005] 但是,鉴于链霉菌的次级代谢调控网络十分复杂,定位到对于土霉素产量确实有 调控作用的基因、且调节该基因的表达对于链霉菌自身生长不造成重大影响的基因仍然是 困难的。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种通过基因阻断提高链霉菌的土霉素产量的方法。
[0007] 在本发明的第一方面,提供一种生产土霉素的方法,所述方法包括:
[0008] (1)在土霉素生产菌株中,下调IsigB基因(类sigB基因,like-sigB)的表达; [0009] (2)培养步骤(1)制备的菌株,从而生产土霉素。
[0010] 在一个优选例中,通过阻断(较佳地为插入阻断)或敲除IsigB基因,从而下调土 霉素生产菌株中IsigB基因的表达。
[0011] 在另一优选例中,在土霉素生产菌株中IsigB基因位置插入外源基因,从而阻断 IsigB基因(较佳地,在该基因中第181-680位区间内插入外源基因)。
[0012] 在另一优选例中,所述的外源基因包括pKC1139质粒中的部分元件,例如ori T、 Ori pSG5、Apr〇
[0013] 在另一优选例中,所述的阻断IsigB基因方法包括:提供表达载体,所述表达载体 中包含IsigB基因的部分序列(较佳地为第181-680位序列),将表达载体转化龟裂链霉 菌,选择基因组中整合有外源基因序列片段的重组龟裂链霉菌。
[0014] 在另一优选例中,所述的土霉素生产菌株是链霉菌。
[0015] 在另一优选例中,步骤(2)的培养方法包括:培养链霉菌孢子以形成菌丝细球,之 后接种至发酵培养基中,30±2°C (较佳地30土 1°C ),220±50rpm(较佳地220±20rpm)发 酵。
[0016] 在另一优选例中,所述的发酵培养基包括按照重量体积比:3%葡萄糖,1 %蛋白 胨,0.07% M0PS,0. 02%氯化钙,0.02%硝酸钠,0. 1%微量元素;其中,各组分的百分含量 可上下浮动10% ;较佳地浮动5%。
[0017] 在本发明的另一方面,提供一种改良的土霉素生产菌株,所述的菌株的基因组中 IsigB基因被阻断或被敲除。
[0018] 在一个优选例中,以IsigB基因的部分序列片段作为同源臂,在土霉素生产菌株 中IsigB基因位置插入外源基因,从而获得IsigB基因被阻断或被敲除的菌株。
[0019] 在另一优选例中,所述的改良的土霉素生产菌株以链霉菌为出发菌株进行改良。
[0020] 在本发明的另一方面,提供IsigB基因的用途,用于作为改良土霉素生产菌株、提 高土霉素产量的靶点。
[0021] 本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0022] 图1、土霉素的出峰时间。
[0023] 图2、M4018: :lsigB突变株构建过程。
[0024] 图3、扩增获得IsigB部分片段及IsigB阻断突变株M4018: : IsigB的验证。
[0025] (A)PCR获得IsigB的部分片段,Lanel、2均为得到的部分IsigB片段。
[0026] (B)pKB 质粒鉴定,Lanel :Xba I、BamH I 双酶切 pKC1139 质粒,Lane2_4 :双酶切验 证pKB质粒。
[0027] (C)M4018::lsigB突变株PCR鉴定,其中,Lane 1 :以M4018基因组为模板,Lane 2 :pKC1139质粒作为模板,Lane 3-7 :以转化子基因组为模板。
[0028] 图4、单位菌体的土霉素产量柱状图。其中,纵坐标单位:0TC/DCW(mg/g)。
【具体实施方式】
[0029] 本发明人经过深入的研究,首次揭示在土霉素生产菌株中,下调(包括阻断或敲 除)IsigB基因后,能够显著地提高土霉素生产菌株的土霉素产量。单位菌体的土霉素合成 量可提高20 %以上。本发明为土霉素生产菌株改造提供了 一个新途径。
[0030] 如本文所用,"外源的"或"异源的"是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质 序列之间的关系。例如,如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的,则启动子 对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是"外源的"。
[0031] NCBI已公开了 IsigB基因序列及其编码的蛋白序列,其氨基酸序列可参见 GenBank 登录号:ELQ80095.1(SEQ ID N0:2)(Sig B/F/G subfamily RNA polymerase sigma-28 subunit),其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。因此,本领域人员易于获得所述 基因。
[0032] 在土霉素生产菌株中下调IsigB基因可以采用多种本领域已知的方法,包括基因 沉默、基因阻断、基因敲除、基因抑制等。这些方法均被包含在本发明中。
[0033] 例如,可以通过基于同源重组的基因插入阻断技术来改造基因组中的IsigB基 因,从而使得IsigB基因被阻断;也可以针对IsigB基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使 IsigB基因表达抑制或沉默。
[0034] 一种下调IsigB基因的方法是基因阻断技术,在本发明的优选实施方式中,体外 构建IsigB基因阻断质粒,通过同源重组的方法,在土霉素生产菌株染色体IsigB基因中 插入其他无关元件,从而使得染色体上的IsigB基因不再能够编码活性的蛋白质。当进行 基因阻断时,无关元件的选择是本领域技术人员易于选择到的,例如应用一些抗性基因。 一种基因阻断(敲除)的方法例如可参见Genetic Manipulation of Streptomyces:a Laboratory Manual中所记载的。较佳地,本发明实施例中,所述的无关元件包括pKC1139 质粒中的部分元件,例如ori T、0ri pSG5、Apr。此外,将IsigB基因进行缺失敲除,使之缺 少发挥功能的关键区域也是一种可行的下调基因的策略。
[0035] 在设计用于进行基因阻断或敲除的构建物时,同时包含抗性筛选基因是优选的, 从而有利于后续筛选出发生基因被阻断或敲除的菌株。
[0036] 基于本发明的新发现,本发明还提供了采用基因插入阻断方法阻断IsigB基因后 获得的土霉素生产菌,该菌株不表达IsigB基因或表达量显著性降低。本发明还涉及所述 菌株的用途,用于高产土霉素。
[0037] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件, 或按照制造厂商所建议的条件。
[0038] I.材料与方法
[0039] 1、质粒、菌株和培养基
[0040] 本发明中,所应用的质粒如表1所示。
[0041] 表1、质粒汇总
[0042]
[0043] 注:AmpR为氨苄青霉素抗性;AprR为阿普拉霉素抗性;KanR为卡那霉素抗性。
[0044] 表2、菌种汇总
[0046] pMD19-lsigB质粒的建立:以K-lsigBF、K-lsigBR为引物,以M4018基因组为模板 扩增IsigB扩增得到IsigB的部分片段,并引入BamHI和Xba I酶切位点,插入到pMD19 (大 连宝生生物有限公司)的BamHI和Xba I位点内,获得pMD19-lsigB质粒。
[0047] 2、培养基配方
[0048] LB培养基(w/V):氯化钠10%,蛋白胨10%,酵母粉5%,去离子水定容至1L后调 节pH至7. 0。固体培养基中加入2%琼脂,121°C灭菌20min。
[0049] 麸皮培养基(w/V):麸皮6 %,琼脂2 %。
[0050] TSB(Tryptone Soya Broth)培养基(w/V) :3% Tryptone Broth。
[0051] MS固体培养基(w/V) :2%黄豆饼粉,2%甘露醇,2%琼脂。
[0052] Emerson 培养基(w/V) :0.4% 蛋白胨,0.4% Beef,0. 1%酵母粉,1%葡萄糖, 0· 25% NaCl,2%琼脂。
[0053] 种子培养基(w/V) :1%葡萄糖,1.5%胰蛋白胨,0.05%酵母粉,0.28%蔗糖, 0. 01 %碳酸?丐。
[0054] 天然发酵培养基(¥八):3%葡萄糖,1%蛋白胨,0.07%10?3,0.02%氯化 钙,0.02 %硝酸钠,0.1 %微量元素。其中微量元素(g/L):氯化锌0.04,六水合氯化 铁0.2,二水合氯化铜0.01,四水合氯化锰0.01,十水合硼酸钠 0.01,四水合钥酸铵 ((ΝΗ4)6 · Μο704)〇· 〇124〇
[0055] 3、试剂盒及工具酶
[0056] 分子克隆所用限制性内切酶均购自Takara生物技术(大连)有限公司。质粒抽 提试剂盒、胶回收试剂盒、片段纯化试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。所用 引物见表3。
[0057] 表3、引物
[0059] 4、培养方法
[0060] (1)龟裂链霉菌M4018孢子悬浮液的制备
[0061] 用无菌棉签蘸取活化后的孢子涂布于MS平板,30°C培养5-7
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1