一种高通量筛选尿素高效利用菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高通量筛选尿素高效利用菌株的方法，属于代谢工程领域。
【背景技术】
[0002] 尿素（urea)，又称碳酰胺（carbamide)，碳酸的二酰胺，分子式为 H2NC0NH2 (CO (NH2) 2，是氮代谢和尿素循环中的关键物质。此外，在清酒和黄酒中，由酿酒酵母 代谢产生的尿素都是EC (氨基甲酸乙酯）最主要的前体物质。在发酵过程中，酵母细胞内的 尿素主要由精氨酸代谢产生。当发酵培养基中无酵母偏好型氮源（谷氨酰胺、天冬酰胺等） 存在时，尿素可以进一步被尿素水解酶降解为二氧化碳和氨。但当酵母偏好型氮源存在时， 尿素水解酶的表达会受到强烈的抑制。这种现象由酿酒酵母的氮源阻遏效应（Nitrogen catabolite repression，简称NCR)调控，可以保证酵母细胞能在复杂的生存环境中优先利 用最利于其生存的氮源。NCR效应的调控会导致酵母细胞内高浓度尿素的积累。由于尿素 对酿酒酵母细胞有毒害作用，因此细胞通过尿素透性酶以主动运输的方式将尿素转运至胞 外。在胞外的发酵液中，尿素可以在发酵的过程中自发的和乙醇反应形成EC(氨基甲酸乙 酯）。
[0003] 因此降低尿素浓度是降低黄酒中致癌物质的必然选择，目前为解决这个问题，已 经构建出大量的工程菌，但其存在食品安全性等问题的限制。因此，从自然界中筛选获得尿 素高效利用的菌株是亟待解决的问题。
[0004] 常规的高效尿素利用菌株是通过从黄酒发酵醪中筛选的方法，改法步骤繁琐，针 对性弱，无法实现高通量。目前，尿素检测方法有比色法、酶联反应法、高效液相色谱法，但 是尿素测定试剂盒（酶偶联反应法）涉及两种酶（脲酶，谷氨酸脱氢酶），其成本高，稳定性 差；而高效液相色谱--荧光检测器法检测精准性高，范围较广，但其不适合进行尿素的高 通量检测。而常规的比色方法，包括二乙酰一肟分光光度法、对二甲氨基苯甲醛法、二乙酰 一肟硫铵脲法。然而（王立媛，2010)文献报道显示，二乙酰一肟分光光度法耗时多、稀释 倍数高等缺点；二乙酰一肟硫铵脲法需要在比色管中沸水浴条件下进行，反应时间久、所需 样品体积大，沸水浴会导致存在反应体系容易损失，而且数据波动较大、回收率吻合度差、 检测范围较窄、不适合大批量检测等。
[0005] 综上，目前自然筛选难度大、筛选效率低，而现有的尿素检测方法存在准确性、稳 定性和精确性差等缺点，无法实现对尿素尚效利用菌株的尚通量筛选。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述问题，本研究通过优化反应将检测范围控制在0. 5~20mg/L，且实 现了尿素高通量检测。本发明的一种高通量筛选尿素高效利用菌株的方法，化学试剂用量 少，能够使单个样本检测成本降低了近95%，而且检测时间短、效率高，可同时检测多个样 本。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种高通量筛选尿素利用菌株的方法，其特征在于， 所述方法是先从生长于尿素为唯一氮源的固体培养基中的待筛菌株中，挑选菌落相对较 大的菌株作为初筛菌株，然后将初筛菌株接种至深孔板中振荡培养制备种子液，再将种子 液以相同接种比例接种至另一深孔板中进行发酵培养，发酵培养结束后将深孔板离心，取 上清液或者稀释后的上清液为待测样本；将40 μ L的待测样本、50 μ L的铁-磷酸溶液和 10yL的二乙酰一肟硫胺脲液，加入PCR板中，于PCR仪中100°C反应lOmin，将反应后的液 体加入96孔板中，用酶标仪测定0D525吸收值y，根据公式y = 45. 45x+0. 062 (R 2= 0. 999) 计算待测样本中尿素浓度X，进而直接得到或者根据稀释比例换算得到上清液中的尿素浓 度，上清液中的尿素浓度相对较小的孔所对应的菌株即为复筛得到的尿素利用菌株；其中， X取值范围为〇· 5-20,单位mg/L。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述待筛菌株为酿酒酵母。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述待筛菌株为黄酒生产菌株。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述种子液是在48或者96深孔板中，于900r/min、 30°C、培养48h得到的。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述接种是100 yL的种子液接种至含有900 yL发 酵培养基的48或者96深孔板中。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养使用的发酵培养基中，按g/L计，含有 葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是在30°C发酵培养72h。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是在48或者96深孔板中进行。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述二乙酰一肟硫胺脲液，是将二乙酰一肟600mg、 硫胺脲30mg加蒸馏水溶解，并加水定容至100mL得到的。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述铁-磷酸溶液是将硫酸高铁铵600mg溶于100mL 浓磷酸中得到的。
[0017] 本发明的有益之处：
[0018] (1)建立了一种高通量筛选尿素高效利用菌株的方法，极大地简化了整个筛选过 程。本发明方法通过优化试剂添加比例等，可使单个样本检测成本降低了近95% (试剂用 量从5mL减少至100 μ L)，筛选周期短，可同时检测96个样本，效率高，简便（可使用排枪， 可同时添加12个孔的样品）。
[0019] (2)本发明准确性高、稳定性高，标准曲线y = 45. 45χ+0· 062(R2= 0· 999)，在黄 酒中加标回收测定，回收率为：98. 2%~101. 18%，平均回收率为99. 47%。本发明的检测 结果与高效液相色谱法检测结果基本一致。
[0020] ⑶按照本发明的方法，可以对黄酒中的尿素高效利用的菌株进行筛选，获得了一 株高效利用菌，可以用于黄酒或者清酒酿造，降低产品中的尿素和氨基甲酸乙酯含量。
【具体实施方式】
[0021] 尿素的测定：高效液相色谱一荧光检测器（HPLC)
[0022] 仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪（配紫外可见检测器、荧光检测器和工作 站），色谱条件：
[0023] 色谱柱：Z0RBAX Eclipse XDB C18 (250X4. 6mm，5 μ m)
[0024] 流动相：2mM CH3C00Na
[0025] 流速：lmL/min
[0026] 柱温：35°C
[0027] 进样量：20 μ L
[0028] 紫外检测器波长：210nm(检测α -酮戊二酸和丙酮酸）
[0029] 荧光检测器波长：激发波长：213nm发射波长：308nm
[0030] 样品制备：lmL发酵液在12, OOOrpm下离心5min，取400 μ L上清液加入20M 9-占 吨醇600 μ L和1. 5Μ的盐酸100 μ L，暗反应30min。然后经0. 22 μ L滤膜过滤，滤液供高效 液相色谱分析。
[0031] 培养基：
[0032] 种子培养基（g/L):葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g。115°C灭菌15min。
[0033] 初筛培养基（g/L):葡萄糖 20g，YNB 1，74g，尿素 5g，琼脂 20g。115°C灭菌 15min。
[0034] 发酵培养基（g/L):葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g。115°C灭菌15min。
[0035] 实施例1 :标准曲线绘制
[0036] 将标准尿素溶液梯度稀释是将标准溶液稀释成0. lmg/L、0. 3mg/L、0. 5mg/L、 1. 0mg/L、l. 5mg/L、3. 0mg/L、4. 5mg/L、5. 0mg/L、6. 0mg/L、8. 0mg/L、10. 0mg/L、20mg/L、30mg/ L，然后将样品（标准尿素溶液）、二乙酰一肟硫胺脲和铁-磷酸溶液以体积比4:1:5混合，