一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全领域，具体地，涉及一种同时检测沙门氏菌（Salmonella)、志 贺氏菌（Shigella)和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus)三种菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 食品中存在的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌导致的食源性疾病呈逐年上 升趋势，给人们的健康带来很大的潜在威胁。由沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在全 球范围内引发的食源性疾病导致大量人员死亡，造成数十亿美元损失。一份2003-2007年 中国细菌性食源性疾病流行病学特征分析显示，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门 氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的比例分别为10. 3%、8. 9%和1.5%，三种致病菌导致 的食源性疾病事件总数占到统计的1060起食源性疾病时间的20%以上。
[0003] 目前应对食品安全突发事件的手段一般为采集样品后送到相关检测机构进行传 统分离培养，经生理生化实验后进行确认或排除。此方法培养时间长、工作量大、实验步骤 繁琐，在很多突发事件中不能及时反映准确的数据。常规PCR方法检测时间短，但其灵敏度 和可能带来的污染是不能不考虑的问题。免疫磁分离技术是将特异性抗体与一定大小的磁 珠偶联，利用特异性抗体能与细胞表面抗原相结合的原理，将磁球与细胞结合，在外磁场的 作用下，将磁球-细胞复合物从环境中分离出来，达到获取目标细胞的一项技术，但是单独 使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进 行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。Taqman探针法多重实时荧光定量PCR技术采用了 封闭式反应体系，采用多组特异性引物及探针，针对多组目标菌进行同时扩增检测，而其准 确性仍有待提1?。
[0004] 目前应用免疫磁分离-多重荧光定量PCR对食品中的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄 色葡萄球菌进行三重检测还未见有报道，值得进一步研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度和准确性不高以及难以实现三种菌株 的同时检测的缺陷，提供一种具有高灵敏度和准确性并能够同时检测沙门氏菌、志贺氏菌 和金黄色葡萄球菌的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的研究，发现食品中的复杂成分、 培养基成分以及DNA提取过程中提取液的残留成分等都是PCR反应的潜在抑制因子，会直 接影响检测结果的准确性。进一步研究后发现，配合使用免疫磁分离技术与多重荧光定量 PCR的方法能够有效地实现沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。因此，本发 明提供了一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤：
[0007] (1)将待测样品与液体培养基混合，并将混合物置于能够使待测样品中可能存在 的细菌扩增的条件下进行培养，获得扩增后的样品；
[0008] (2)利用免疫磁珠捕获扩增后的样品中可能存在的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；
[0009] (3)提取步骤⑴中捕获的菌体的基因组DNA ;
[0010] (4)采用针对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的特异性引物对提取到的基 因组DNA进行多重荧光定量PCR，根据多重荧光定量PCR的结果确定待测样品中沙门氏菌、 志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的存在。
[0011] 通过上述技术方案，本发明实现了沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的同时 检测，灵敏度高且结果准确。而且，本发明方法能够快捷地对待测样品中的沙门氏菌、志 贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，对提高快速应对食品安全突发事件的能力具有重大意 义。
[0012] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0013] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的单位"CFU/g"意指以每克待测样品 为基准的菌株的CFU数；使用的术语"免疫磁珠"是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微 球（或磁球）的表面上，形成的免疫磁性微球；术语"PCR"是指聚合酶链式反应；术语"引 物"包括至少一个上游引物和至少一个下游引物；本发明中使用的液体体积均为20°C下的 数值。
[0015] 本发明提供了 一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，该方法包 括以下步骤：
[0016] (1)将待测样品与液体培养基混合，并将混合物置于能够使待测样品中可能存在 的细菌扩增的条件下进行培养，获得扩增后的样品；
[0017] (2)利用免疫磁珠捕获扩增后的样品中可能存在的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色 葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；
[0018] (3)提取步骤⑴中捕获的菌体的基因组DNA ;
[0019] (4)采用针对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的特异性引物对提取到的基 因组DNA进行多重荧光定量PCR，根据多重荧光定量PCR的结果确定待测样品中沙门氏菌、 志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的存在。
[0020] 根据本发明，为了准确地检测待测样品中三种菌株的存在，需要在免疫磁分离之 前对待测样品进行细菌扩增处理，从而扩增待测样品中可能存在的细菌，特别是沙门氏菌、 志贺氏菌和金黄色葡萄球菌。所述液体培养基可以为本领域常规用于细菌培养的培养基， 如营养肉汤培养基（优选为加入有〇. 8-1. 2重量％的甘氨酸的营养肉汤培养基）。所述培 养的条件也可以为常规选择，例如，培养的温度可以为35-38°C，培养的时间可以为4-6h， 可以利用摇床进行所述培养，而摇床的转速通常可以设置为100_200rpm。本发明中，经培养 步骤获得的培养物即可直接作为扩增后的样品。
[0021] 根据本发明，抗体与磁球偶联获得所述免疫磁珠的方法可以为常规方法，例 如，可以按照文献（刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生， 2008,11:1349-1351)中的方法进行。
[0022] 为了捕获待测样品中的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，所述抗体包括分 别能够与沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌特异性结合的抗体，优选地，所述抗体包括 沙门氏菌多克隆抗体、志贺氏菌多克隆抗体和金黄色葡萄球菌多克隆抗体，更优选包括购 自Meridian公司的商品号（Cat. #)为G5V61-500的兔抗沙门氏菌抗体、购自Meridian公司 的商品号（Cat. #)为B65901R的兔抗志贺氏菌抗体和购自Meridian公司的商品号（Cat. #) 为B65881R的兔抗金黄色葡萄球菌抗体。
[0023] 所述磁球可以为各种常规用于免疫磁分离的磁球，例如，可以为表面修饰有氨基 或羧基的超顺磁性Fe304聚苯乙烯复合微球。优选情况下，所述磁球的粒径为150-200nm。
[0024] 优选情况下，相对于每毫克的磁球，所述抗体的用量彡0. lmg，更优选为0. 1-lmg。 在实际操作时，可以由不同抗体分别制得三种免疫磁珠，进行免疫磁分离捕获时再将三者 加入体系中。
[0025] 优选情况下，相对于每毫升的扩增后的样品，以磁球的重量计，所述免疫磁珠的用 量为0. 5-5 μ g，更优选为2-3 μ g。
[0026] 根据本发明，利用免疫磁珠捕获三种菌体可以借助免疫磁分离系统（例如Matrix Pathatrix免疫磁分离系统）进行，对所述捕获的条件没有特别的限定，优选地，步骤（1) 中，捕获的条件包括：温度为35-38°C，时间为25-35min。
[0027] 根据本发明，对步骤（2)中提取基因组DNA的具体方法没有特别的要求，可以为本 领域常规采用的提取DNA的方法，可以使用细菌基因组DNA提取试剂盒，具体操作及条件可 以参见试剂盒的说明书。
[0028] 根据本发明，所述多重荧光定量PCR为三重荧光定量PCR，所述特异性引物优选 为能够特异地扩增沙门氏菌的NAa基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 :10所示）、志贺氏菌 的 ipaH 基因 （Accession Number :M76445)和金黄色葡萄球菌的 Sa442 基因 （Accession Number :AF〇33l9l)的引物。
[0029] 进一步优选地，多重荧光定量PCR所使用的上游引物、下游引物以及相应的特异 性荧光探针的核苷酸序列如下：
[0030] 上游引物 1 :5' -GCTATTTTCGTCCGGCATGA-3'（SEQ ID NO :1)
[0031] 下游引物 1 :5' -GCGACTATCAGGTTACCGTGGA-3'（SEQ ID NO :2)
[0032] 特异性荧光探针 1 :5' -TAGCCAGCGAGGTGAAAACGACAAAGG-3'（SEQ ID NO :7)
[0033] 上游引物 2 :5' -CTTGACCGCCTTTCCGATA-3'（SEQ ID NO :3)
[0034] 下游引物 2 :5' -AGCGAAAGACTGCTGTCGAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0035] 特异性荧光探针 2 :5' -AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-3'（SEQ ID NO :8)
[0036] 上游引物 3 :5, -T